pcr技术检测病毒

2024-08-30

pcr技术检测病毒（通用11篇）

1.pcr技术检测病毒篇一

乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒

样本要求

1.适用标本类型：血清或血浆 2.标本采集

1）血清：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温放置30—60min，血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500 rpm离心5分钟，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管

2）血浆：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含EDTA-2K或枸橼酸钠的玻璃管，立即颠倒玻璃管混合5—10次，使抗凝剂和静脉血充分混匀，5—10分钟后即可分离血浆，转移至1.5 ml灭菌离心管

3.标本保存与运送：所采集的标本可立即用于测试，也可以保存在—20℃待测，保存期为6个月，标本运送采用0℃冰壶。检验方法

1.DNA提取（样品制备区）

将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV 强阳性质控品、HBV临界阳性质控品进行同步处理。1）取200μl样品，加入450μlDNA提取液I和4μl的内标溶液，用振荡器剧烈混匀15秒，瞬时离心数秒。100℃恒温处理10±1分钟 2）12000rpm离心5分钟，备用 2.PCR试剂准备（试剂准备区）直接使用HBV-PCR反应管 3.加样（样品制备区）

往上述HBV反应管中用带滤芯吸嘴分别加入待测样本、阴性质控品、HBV 强阳性质控品、HBV临界阳性质控品和阳性定量参考品的上清液各20μl。盖紧管盖，8000rpm离心数秒后转移至扩增检测区。

4.PCR扩增（扩增和产物分析区）5.结果分析

反应结束后自动保存结果，根据分析后的图像调节baseline值得Start值、End值以及Threshold值，点击Analysis自动获取分析结果，在Repoet界面查看结果，记录未知样本数值（C）6.质量控制

(1)阴性质控品：FAM通道无对数增长期或Ct值等于30，VIC检测通道扩增曲线为明显对数增长期

(2)HBV阳性质控品：FAM通道有明显的对数增长期且Ct值小于30(3)HBV阳性定量参考品：FAM通道有明显的对数增长期，呈典型S形曲线。CT<29且R²>0.98 7.结果判断（1）如果在FAM通道无明显的对数增长期或Ct值等于30，在VIC检测通道扩增曲线有对数增长期，则判定样本的HBV DNA浓度小于检测灵敏度。（2）如果在FAM通道有对数增长期或Ct值小于30 则1）若样本的C<100，则样本的HBV DNA浓度<100IU/ml 2）若样本的100《C《5.00E+008，则样本的HBV DNA浓度= C IU/ml 3）若样本的C>5.00E+008，则样本的HBV DNA浓度>5×10 ⁿ IU/ml

2.pcr技术检测病毒篇二

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和毒株

已克隆PRRSV高致病性毒株TJ-H1和经典株TJ-H3的nsp2基因的质粒由本实验室构建, Genbank登录号分别为GQ923891、GQ923892、GQ923893。猪繁殖与呼吸系统综合征病毒 (PRRSV) 抗体阳性血清12份由天津市动物疫病预防控制中心提供。

1.1.2 仪器和试剂

高速冷冻离心机购自力康公司, Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR仪购自Applied Biosystems公司。Trizol试剂购自北京康为世纪生物公司, 反转录酶购自杭州博日科技公司, Taq DNA聚合酶购自北京全式金生物公司, 引物由北京奥科生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计

运用DNAMAN软件对nsp2基因缺失株TJ-H1和经典株TJ-H3的核苷酸序列进行比对, 结合GenBank数据库中其他株PRRSV的序列特点, 在缺失部分的上游设计一条上游引物nsp2-1, 在缺失部分和缺失部分的下游各设计一条下游引物nsp2-2和nsp2-3。三条引物的序列如下:nsp2-1:CCTAA CGGTT GGGAA GATTT GACTG;nsp2-2:CCACC TGCTG AAATT TGTGT CGC;nsp2-3:A-CACA GGTGC AGGGT TGATG TCATT。

1.2.2 PCR反应体系的优化

分别以TJ-H1和TJ-H3 nsp2-T载体为模板, 对退火温度、循环次数及双重PCR反应中三条引物的最佳浓度配比等进行优化, 确定PCR反应的最佳条件。

1.2.3 PCR反应特异性和敏感性检测

分别以nsp2-1、nsp2-2引物, nsp2-1、nsp2-3引物和nsp2-1、nsp2-2、nsp2-3引物对TJ-H1和TJ-H3进行扩增, 确定PCR反应的特异性。

分别以TJ-H1和TJ-H3 nsp2-T载体为模板, 进行10倍梯度稀释, 用nsp2-1、nsp2-3扩增, 确定PCR反应的灵敏性。

1.2.4 Real-time FQ-PCR

将TJ-H1和TJ-H3 nsp2-T载体进行10倍梯度稀释, 分别利用nsp2-1、nsp2-2, nsp2-1、nsp2-3和nsp2-1、nsp2-2、nsp2-3扩增TJ-H3以及利用nsp2-1、nsp2-3扩增TJ-H1, 扩增参数为:95℃10min, 1个循环;95℃15s, 57℃45s, 40个循环, 最后进行标准曲线的绘制。

1.2.5 抗体阳性血清的检测

Trizol试剂提取感染PRRSV细胞的总RNA, DEPC水溶解后置-40℃冰箱备用。反转录产物作为模板, 用于SYBR Green荧光定量PCR反应。实验结果与1.2.4中建立的标准曲线进行比较。

2 结果与分析

2.1 PCR反应的最佳参数

经过数次对dNTPs浓度、引物浓度及退火温度进行优化筛选, 从而确立了50μL PCR反应体系为:10×Buffer (含Mg Cl2) 5μL, 模板DNA 1μL, 上游引物 (25pmol/μL) 1μL, 下游引物 (25pmol/μL) 1μL, dNTPs (10mmol/L) 1μL, TaqDNA聚合酶 (2.5Μ/μL) 1μL, 双蒸水补至50μL。反应程序为:94℃3 min, 1个循环;94℃40s, 55℃30s, 72℃30s, 共5个循环;94℃40s, 57℃30s, 72℃30s, 共30个循环;72℃8min, 1个循环;4℃3min。

双重PCR反应的最佳参数为:上游引物 (25pmol/μL) 1μL, 中游引物 (25pmol/μL) 0.5μL, 下游引物 (25pmol/μL) 1μL, 其他同上。

2.2 敏感性和特异性检测

PCR扩增结果如图1所示, 在1.0%琼脂糖凝胶中电泳中可以得到清晰的目的条带, 大小符合预期。

PCR灵敏度实验结果如图2、3所示, TJ-H3可以检测到3×102copies/μL, TJ-H1可以检测到6×102copies/μL, 条带大小均符合预期。双重PCR TJ-H3可检测到3×102 copies/μL。

2.3 SYBR Green荧光定量PCR

图5和6表明在加入nsp-1、nsp-3引物后TJ-H3和TJ-H1分别可检测到3copies/μL和6copies/μL, 通过熔解曲线分析发现, TJ-H3和TJ-H1的Tm值分别为89℃和77℃, 以此可以鉴别TJ-H3和TJ-H1。同时加入nsp-1、nsp-2和nsp-3引物时TJ-H3可检测到3×102copies/μL, Tm值约为87℃。

2.4 12株样本结果

12株样本加入nsp2-1、nsp2-3的扩增曲线表明, 12株样本均为PRRSV阳性样本, 通过熔解曲线分析发现, 12株样本的Tm值约在77℃, 符合高致病性nsp2基因缺失型的特征, 确定12株样本均为TJ-H1。PCR检测结果表明扩增条带约为244bp, 两者结论一致, 确定样本均为TJ-H1。

3.1 利用SYBR Green荧光定量PCR方法区分TJ-H1和TJ-H3

在利用nsp2-1和nsp2-3分别对TJ-H1和TJ-H3进行荧光定量PCR实验时, 由于两者扩增的目的片段大小、GC/AT值、核酸序列以及空间结构等存在差异, 经熔解曲线分析后也会出现不同的Tm值, 可根据此值区分TJ-H1和TJ-H3。12株抗体阳性的样本的荧光定量PCR的结果证明了此方法的准确性。因此, 在临床应用中可以利用nsp2-1和nsp2-3对样本进行扩增, 便可快速的检测出TJ-H1和TJ-H3。

3.2 引物扩增效率及熔解曲线分析

在PCR条件优化过程中发现, nsp2-1、nsp2-2对TJ-H3的扩增效率要高于nsp2-1、nsp2-3。这与nsp2-1、nsp2-3引物对间5’端CG钳的能量和Tm值分布情况不如nsp2-1、nsp2-2引物对有关。通过调节3条引物的浓度, 使双重PCR中检测的灵敏度、特异性条带的观察获得了理想结果。进一步将3条引物的最佳浓度配比应用于SYBR Green荧光定量PCR实验中, 四组实验的熔解曲线没有明显的杂峰, 说明了经过优化的引物浓度配比进一步提高了SYBR Green荧光定量PCR实验结果的稳定性和可靠性。

熔解曲线是SYBR Green荧光定量PCR实验中对扩增产物分析的重要辅助手段, 一般而言, 熔解曲线越高瘦, 表明扩增产物的特异性越良好, 产物量越多。熔解曲线矮胖时, 说明扩增产物量少并且特异性差。利用设计的鉴别引物扩增PRRSV, 因扩增产物条带大小不同, 熔解曲线Tm值有明显差异, 即可鉴别基因缺失与经典株。

应用建立的荧光定量PCR, 可以检出3~6个拷贝的质粒, 敏感性高于常规PCR。另外, 常规PCR需要进行扩增、电泳等过程, 整个过程耗时大约3~4h, 荧光定量PCR扩增和熔解曲线分析一共需要约90min, 时效性良好。建立的SYBR Green荧光定量PCR方法比传统PCR方法在灵敏性、准确性、时效性等方面具有明显的优势, 可满足临床上简变、快速、准确进行区分鉴定的要求。

3.3 12株毒株荧光定量PCR结果分析

有报道称2006~2007年我国大部分省份发生的猪高热综合症, 从病猪体内分离到变异PRRSV。本实验中应用SYBR Green荧光定量PCR方法检测的结果显示所有12株样本均为TJ-H1阳性, 这与报道中的结论相吻合, 表明目前天津周边某地2009年流行的PRRSV主要为nsp2缺失的病毒毒株。

摘要：为了能准确、快速的检测nsp2基因缺失的猪繁殖与呼吸系统综合征变异病毒 (PRRSV) , 在nsp2基因核苷酸序列上设计了一条上游引物 (nsp2-1) 和两条下游引物 (nsp2-2, nsp2-3) , 其中一条下游引物 (nsp2-2) 设计在缺失碱基序列区域。通过条件优化建立了区分经典株和高致病性nsp2基因缺失株的PCR方法;并将最优化条件运用于SYBR Green荧光定量PCR实验, 建立了根据融解曲线鉴别nsp2缺失变异株的荧光定量PCR方法, 可检出3～6个基因拷贝。

关键词：PRRSV,nsp2基因,SYBR Green荧光定量PCR

参考文献

[1]希尼尼根等, 猪繁殖与呼吸综合征研究进展[J].养猪, 2004, (4) :36-38.

[2]Keffaber KK.Reproductive failure of unknown etiology.AmAssoc SwinePrac News, 1989, 1:1-9.

[3]Eric J Snijder, et al.The molecular biology of arteriviruses[J].Journal of General Virology, 1998, 79 (5) :961-979.

3.pcr技术检测病毒篇三

关键词：PCR 原理与技术食品检验应用

中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）02-0038-01

1 引言

上世纪80年代中期，分子生物学领域诞生了一项新技术，称作DNA体外扩增法，简称为PCR技术。其基本原理是在生物体的体外，对指定DNA双链片断进行扩增。第一步：挑选出指定DNA双链片断，人工合成指定DNA双链片断端头邻近序列互补的寡核苷酸片断，将该互补片段称作引物（Primer），引物也是双链结构，分作左端引物和右端引物。第二步：加热指定DNA双链片断，使之发生变性，分裂成单链，把左右引物与之分别配对进行互补结合。第三步：在DNA聚合酶和4种dNTPs底物的共同作用下，引物沿模板DNA链按5/→3/方向延伸，合成DNA双链，这个步骤被称为DNA多聚酶链反应。第四步：以新合成的DNA双链作为扩增模板，重复DNA多聚酶链反应步骤。历经25～35次循环，可将DNA序列扩增到近百万倍。该技术具有特异性强、灵敏度高、扩增快速准确等优点，自诞生之日起，其实用性在医学、农学、环境科学、食品检验等领域得到了很好的印证。

2 PCR技术在食品检测方面的应用

2.1 PCR技术的检测原理

PCR技术最根本的鉴定依据是生物的DNA结构具有唯一性。在食品检测中，起到鉴定标准模板作用的是引物，从理论上说，①如果引物来自DNA保守区，则在扩增之后，所有被检测对象都含有DNA保守区的片段；②如果引物来自DNA特异区，则在扩增之后，所有被检测对象都含有DNA特异区的片段。以上两种理论依据就是PCR技术的检测原理。

在实际应用中，人工有选择地截取DNA片段，使用DNA多聚酶链反应，可以在2～3小时之内达到常规检测需要数天才能达到的培养效果，另外还省去了繁琐的种属鉴定等工作，简化了检测流程。

2.2 PCR技术的操作程序

（1）待检样品的浓集（增菌）。食品中待检的微生物群落浓度一般都是比较低的，达不到检测要求。这就需要进行待检微生物的浓集。

（2）核酸的提取。为了实现PCR扩增，必须提取待检样品的核酸。常用的处理方法包括：加热、反复冻融、化学裂解。

（3）PCR扩增。在扩增过程中，最关键的莫过于引物，它直接关系到PCR检测的成败。扩增需要20—40个反应循环，每个循环都由高温变性、低温退火、适温延伸组成。高温时，氢键打开，双链变为单链，生成扩增模板；低温时，左引物和右引物分别与模板DNA的2条单链做互补结合，完成配对；适温时，在聚合酶作用下，4种三磷酸脱氧核苷（A、T、G、C）按碱基互补配对原则不断进行配对添加，按5/→3/方向自动合成新的DNA双链片段。

变性温度一般需保持在94℃左右，如果待扩增区域DNA的G+C含量太高，则可考虑适当提高变性温度。

退火温度与引物的G+C含量有关，根据公式：Ta=4×（G+C）+2×（A+T）-5。

延伸温度一般需保持在72℃左右，此时DNA聚合酶的聚合速度约1000（碱基）/min。

（4）扩增产物的检测。常用的检测方法为琼脂糖凝胶电泳法，琼脂糖质量分数在0.8%～2%之间。待分离DNA片断的分子量越小，所需琼脂糖质量分数则越大，反之亦然。

3 PCR技术用于食品检测的优缺点

3.1 PCR技术的优点

传统检测方法多采用平板培养法，通过菌落计数来判断菌体浓度。传统方法的优点是操作简单，其最大的缺点是消耗的时间太长，检测周期一般在3——10天。

PCR技术的最大优点就是检测速度快，使用特异区扩增检测，只要在几个小时内成功扩增，即可检验并判断出待检测样品的种类，非常迅捷、灵敏。

3.2 PCR技术的缺点

任何事物都不是完美的，PCR技术一样存在缺点，正是这些缺点的存在，导致其不能完全取代传统检测法。其主要缺点包括：（1）假阳性问题。核酸受到污染而造成假阳性的问题，是PCR技术的最大缺点。这个缺点来自扩增本身，在扩增的过程中，即使只有一个污染源，结果也会出现成十万成百万倍的污染现象，造成检测结果出现阳性，称之为假阳性。

防止假阳性问题，目前只有做好隔离这一种办法。（2）假阴性问题。假阳性问题来自PCR技术本身，假阴性问题则来自待测样品。食品成分复杂，其中多种成分发生了复杂的化学反应，不能排除模板液中带有某种或某些抑制PCR反应的成分。防止假阴性问题的办法是设置阳性对照环节。（3）定量检测困难。由于影响PCR产率的原因比较多，在定量检测方面不能提供较为精准的数据，导致PCR技术无法胜任定量检测。直至目前，尚没有实质性的突破与进展，限制了PCR技术在检测方面的应用范围。

4 结论

PCR检测有一定的局限性，但是，其高灵敏度的检测反应、明显的特异性辨别、快速简便的检测流程，是其它检测方法所不能替代的。相信随着生物技术的快速进步，PCR检测技术的应用范围會越来越广泛。

参考文献

[1]常玉华，仇农学.基于PCR技术快速检测食品微生物的原理方法与应用[J].农产品加工，2011（11）.

[2]张泽民，李曼.PGR技术在转基因食品检测中的应用与发展趋势[J].农牧产品工程，2011（7）.

4.pcr技术检测病毒篇四

多重PCR技术在病原检测中的应用

多重PCR能够同时扩增不同片段,具有普通PCR方法不可比拟的优势.简要论述了多重PCR在细菌病原体的检测、病毒病原体的检测、支原体和衣原体及寄生虫的检测、微生物耐药性检测等方面的应用,分析了多重PCR的.影响因素及条件优化,并进一步综述了多重PCR的应用前景.

作者：赵红庆苑锡铜黄留玉 ZHAO Hong-qing YUAN Xi-tong HUANG Liu-yu 作者单位：军事医学科学院,疾病预防控制所传染病控制中心,北京,100071刊名：生物技术通讯 ISTIC英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：18(5)分类号：Q503 R372关键词：多重PCR 病原检测影响因素

5.pcr技术检测病毒篇五

甘蔗线虫病抗性基因的PCR检测研究

以38份未经线虫病常规鉴定的甘蔗种质资源为供试材料,根据番茄抗根结线虫病基因和甜菜抗胞囊线虫病基因的.保守序列区域,分别设计了2条上游引物、2条下游引物,对设计的引物进行组合后,应用PCR特异扩增从中分别筛选出各1对特异引物.用抗根结线虫基因设计的特异引物进行扩增最终获得了1条大约460bp大小的特异片段;用抗胞囊线虫基因设计的特异引物进行扩增最终获得了1条大约690 bp大小的特异片段,进一步进行了PCR-Southern杂交,确认了该2条特异引物的真实性.

作者：吴杨周会潘大仁 WU Yang ZHOU Hui PAN Da-Ren 作者单位：福建农林大学作物学院,福建,福州,350002 刊名：作物学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA AGRONOMICA SINICA 年，卷(期)： 32(6) 分类号：S4 关键词：甘蔗抗线虫基因基因检测 PCR-Southern杂交

6.pcr技术检测病毒篇六

根据GenBank中瘦蛋白(leptin)基因序列设计合成了引物和探针,对荧光定量PCR的方法进行了方法学的评估,建立了TaqmanMGB荧光定量RT-PCR检测方法.结果表明,由pMD-18T瘦蛋白所构建的.标准曲线线性关系良好,建立的瘦蛋白基因荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强(可检测出低于10个拷贝/μL的样品),准确可靠.

作者：张才牛淑玲夏成刘国文王哲 ZHANG Cai NIU Shu-ling XIA Cheng LIU Guo-wen WANG Zhe 作者单位：张才,牛淑玲,刘国文,王哲,ZHANG Cai,NIU Shu-ling,LIU Guo-wen,WANG Zhe(吉林大学,畜牧兽医学院,吉林,长春,130062)

夏成,XIA Cheng(黑龙江八一农垦大学,动物科技学院,黑龙江,大庆,163319)

7.pcr技术检测病毒篇七

目前PCV-2常用的检测方法主要有病毒分离与鉴定、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组织化学法(IHC)、原位核酸分子杂交技术等,但在操作程序、检测时间、特异性检测等方面尚不理想,因此生产实践中需要一种快速、特异、敏感的PCV-2检测技术来准确检测圆环病毒病,并为该病的防治提供事实和理论依据。本试验旨在对比新疆天康畜牧生物技术股份有限公司技术中心实验室建立的常规PCR和荧光定量PCR检测方法的优缺点,为实验室或者临床中PCV-2的准确、快速检测提供帮助。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

荧光定量PCR仪,购自Bio-Rad公司;普通PCR仪,购自Eppendorf公司;琼脂糖,购自Invitrogen公司;PCR试剂盒、DL-2 000 Marker等,购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 标准阳性模板

包含PCV-2-ORF2全基因的重组质粒p MD-PCV-2-ORF2,新疆天康畜牧生物技术股份有限公司技术中心实验室构建保存。

1.3 标准阳性模板的制备

培养含p MD-PCV-2-ORF2的工程菌,提取质粒,用核酸蛋白分析仪测定其浓度,并计算标准品的拷贝数。将重组质粒稀释至1.0×1010拷贝数/μL后再倍比稀释成含质粒数量分别为109,108,107,106,105,104,103,102,101,100拷贝数的标准阳性模板,-80℃保存,备用。

1.4 引物设计与合成

1.4.1 荧光定量PCR引物和探针的设计

根据Gen Bank发表的PCV-2-ORF2基因序列中的保守片段设计1对特异引物和Taq-Man探针,由宝生物工程(大连)有限公司合成,探针的5'端用FAM标记,3'端用TAMRA标记,扩增目的片段长度为106 bp。具体序列如下。

引物F(上游):5'-CCCTATGTAAACTACTCCT C-3';引物R(下游):5'-GGAAGTAATCAATAGTG-GAAT C-3'。

探针序列:5'-(FAM)ACCATAACCCAGCCCT-TCTCC(TAMRA)-3'。

1.4.2 普通PCR引物和探针的设计

根据GenBank发表的PCV-2-ORF2基因序列中的保守片段设计1对特异引物,扩增目的片段长度为494 bp,由宝生物工程(大连)有限公司合成。具体序列如下。

引物P1(上游):5'-CACGGATATTGTAGTCCT-GGT-3';引物P2(下游):5'-CGCACCTTCG-GATATACTGTC-3'。

1.5 反应条件

1.5.1 荧光定量PCR反应条件

经过反复试验确定出最佳反应条件:PCR反应体系为25μL,其中Premix Ex Taq 12.5μL,上、下游引物(终浓度为10μmol/L)各0.5μL,探针(终浓度为10μmol/L)0.25μL,模板DNA 2μL,去离子水9.25μL。荧光定量PCR反应条件:95℃预变性30 s,95℃变性5 s,57.4℃退火延伸30 s,40个循环。

1.5.2 普通PCR反应条件

经过反复试验选出最佳反应条件:PCR反应体系为25μL,其中上游引物P1 1μL,下游引物P2 1μL,10×PCR Buffer(Mg Cl2Plus)2.5μL,d NTP Mixture(2.5 mmol/L)4μL,La Taq(2.5 U/μL)0.25μL,模板DNA 5μL,去离子水11.25μL。反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性1 min,54℃退火40 s,72℃延伸1 min,30个循环;72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,置紫外灯下观察。

1.6 临床样品检测

临床送检的158份病料用常规PCR和荧光定量PCR方法进行检测。

2 结果

2.1 重组质粒浓度的测定

提取的p MD-PCV-2-ORF2质粒,经核酸蛋白分析仪测定其质量浓度为449.9 ng/μL,并计算其拷贝数为9.84×1010拷贝数/μL,OD260/OD280值为1.80,符合纯度要求。

2.2 荧光定量PCR标准曲线的建立

根据重组质粒浓度测定结果,选择106,105,104,103,102,101拷贝数/μL 6个梯度浓度的质粒为模板,制作标准曲线(见图1)。标准曲线斜率为-3.354,轴截距为35.337,线性方程为Y=-3.354X+35.337,相关系数r为0.999,表明线性关系很好。

2.3 荧光定量PCR敏感性试验

以10倍系列稀释的p MD-PCV-2-ORF2标准质粒(1.0×106~1.0×101拷贝数/μL)为模板进行扩增,1.0×101拷贝数/μL仍有荧光曲线,表明该方法检测灵敏度为1.0×101拷贝数/μL。荧光曲线见图2。

2.4 普通PCR特异性与敏感性试验

选用101~1010拷贝数/μL 10个梯度浓度的质粒为模板进行扩增,凝胶电泳结果显示:当模板浓度≤1.0×104拷贝数/μL时,无法扩增出特异性目的条带。凝胶电泳检测结果见图3。

2.5 临床样品检测

对临床送检的158份病料用常规PCR法和荧光定量PCR法进行检测,结果见表1。荧光定量PCR法比常规PCR法的检出率高出8.86个百分点,表明荧光定量PCR法更加敏感。

-.PCR阴性对照;M.DL-2 000 Marker;1~10.101~1010拷贝数/μL。

3 讨论

断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)是1997年首次在加拿大的SPF猪群中被发现,随后在世界范围内广泛流行,自2001年起,我国的一些猪场也发现了PMWS[3]。PMWS主要侵害6~12周龄仔猪,引起淋巴系统疾病、渐进性消瘦、呼吸道症状及黄疸,造成病猪免疫机能下降、生产性能降低。现已证明PCV-2是导致PMWS的主要病原,特别是在有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和伪狂犬病毒(PRV)存在的情况下,该病的阳性率更高[4],是当前严重危害我国养猪业的重要疫病之一。

圆环病毒病的确诊需要进行病毒分离,PCV-2在细胞上不产生细胞病变,且需将PCV-2盲传多代后才能使病毒有效增值,有时连续传代会导致病毒抗原性的改变,因此病毒的分离费力耗时,不适合快速诊断。国内外已有多种诊断试剂盒,如ELISA、IFA等,但其非特异性较高,且价格昂贵。常规PCR方法可以快速、敏感、特异地定性检测PCV-2,具有简单、易操作、设备价格较低、人员素质要求不高的优点,但也存在非特异性扩增造成的假阳性结果需要PCR后处理的缺点。荧光定量PCR可以对样品中的病毒含量进行准确的定量检测,具有结果直观、灵敏度高、特异性强的优点[5],同时也存在设备及试剂价格较高、对人员的素质要求较高、在基层推广性低的缺点。

参考文献

[1]ALLAN G M,mc NEILLY F,KENNEDY S,et al.Isolation of porcine circovirus 2 like viruses frompigs with a wasting disease in the USA and Europe[J].J Vet Diagn Invest,1998,10(1):3-10.

[2]李海超,王娟,黄秀梅,等.猪圆环病毒2型免疫应答机制研究进展[J].动物医学进展,2014,35(2):105-109.

[3]吕艳丽,杨汉春,郭鑫.用PCR方法检测猪圆环病毒Ⅱ型[J].中国兽医学报,2002,22(6):552-554.

[4]张治涛,李玉峰,姜平,等.猪圆环病毒2型感染的检测与流行病学调查[J].中国兽医学报,2008,28(3):227-231.

8.pcr技术检测病毒篇八

摘要:采用细菌的16S rDNA保守区引物作为通用引物,对常见食源性致泻大肠埃希氏菌(Diarrheogenic Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonellae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)进行PCR扩增,产物及其Xmn I酶切后产物进行单链构象多态性分析。试验结果显示,4种食源性致病菌的PCR产物经Xmn I酶切后进行单链构象多态性分析可以相互区别。因此,PCR-SSCP技术可以方便地用于检测食源性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌。

关键词:食源性致病菌;聚合酶链式反应;单链构象多态性;检测

中图分类号: Q503 文献标识码: A 文章编号:1006-6500(2009)01-0001-0013-03

Study on Detection of Four Kinds of Food-borne Pathogenic Bacteria by PCR-SSCP

WANG Yong,ZHAO Xin,LAN Qing-kuo,ZHU Zhu,CHENG Yi

(Central Lab,Tianjin Academy of Agricultural Sciences,Tianjin 300384,China)

Abstract:In order to establish a detection method for identification of four kinds of food-borne pathogenic bacteria including Diarrheogenic Escherichia coli, Salmonellae, Staphylococcus aureus and Bacillus cereus by using polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP), the bacterial 16S rDNA primers conservative region as a universal primers, PCR product and Xmn I digested products of E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus and bacillus cereus were analyzed by single strand conformation polymorphism. The results showed that four kinds of food-borne pathogens could be distinguished between each other, after digesting the PCR products by Xmn I. So, PCR-SSCP technique can be used to facilitate the detection of food-borne E. coli, Salmonella, Staphylococcus aureus and Bacillus cereus.

Key words: food-borne pathogenic bacteria;PCR;SSCP;detection

食品安全是直接关系到消费者生命、健康和社会稳定的热点问题。食品法典委员会(CAC)将微生物性健康危害列为食源性危害的三大原因之一,我国近年微生物性食物中毒比例高达67%[1]。因此,食源性致病菌的检测与鉴定已成为食品行业不可或缺的关键环节。传统的细菌学检验与鉴定需要进行增菌、分离培养以及生化反应等繁琐步骤,既费时又费力,但对于有些细菌仍无法给出正确的鉴定[2]。随着分子生物学技术的发展,PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、荧光原位杂交技术(FISH)、基因芯片(Microarry)、流式细胞技术(FCM)等技术被广泛用于微生物种群鉴定及临床诊断,上述问题迎刃而解。

聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术是建立在PCR基础上的单链构象多态性分析技术。SSCP技术在原理上甚至可以检测出基因片段中单个碱基的差异[3-4]。16S rDNA是细菌相对保守的基因,经常用于细菌分类。本试验旨在探讨以16S rDNA保守区段为PCR扩增对象,运用SSCP技术对致泻大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌以及蜡样芽胞杆菌进行分析,以期为食源性致病菌的快速鉴定提供方法依据。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1菌株的选择与培养标准菌株选取致泻大肠埃希氏菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌,以上菌株均为ATCC标准菌株,本室保存。菌株复苏后接种于相应的增菌培养基中过夜培养。

1.1.2 主要试剂和仪器PCR引物由上海生工公司合成,Taq酶、dNTP、PCR产物纯化试剂盒等购自Promega公司,Chelex-100购自Sigma公司,限制性内切酶Xmn I购自BBI公司,高速冷冻离心机为Backman公司产品,凝胶电泳设备为BIO-RAD Power 200及Power 1000,PCR扩增仪为Thermo PX2,凝胶成像设备为北京六一公司产品。

1.2 方法

1.2.1 标准菌株DNA的提取菌株接种于增菌培养基过夜培养,取培养液100 μL,5 000 r/min离心3 min,弃上清,沉淀用无菌水洗两次,加入100 μL10% Chelex-100,沸水浴5 min,12 000 r/min离心取上清液作为PCR反应的DNA模板[5]。

1.2.2 16S rDNA引物的选择选择在16S rDNA的保守序列区间(1 170~1 189,1 522~1 540)作为本研究通用引物,引物序列:上游引物 5'-AACTGGAGGAAGGTGGGGAT-3';下游引物 5'-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3',扩增产物大小为370 bp[6]。

1.2.3 PCR扩增及PCR反应体系组成 10×PCR反应缓冲液(含Mg2+ )2.5 μL,dNTP溶液(各为10 mmol/μL)0.5 μL,正反引物(10 pmol/μL)各0.5 μL,Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL,模板5 μL,水补足反应体系,使总体积为25 μL。循环参数为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性40 s,55 ℃复性40 s,72 ℃延伸40 s,30个循环,最后72 ℃延伸5 min。扩增产物于加入EB的2.0% 琼脂糖凝胶上电泳,紫外灯下观察,用DL 2 000做分子量标记。

1.2.4 扩增产物的纯化PCR扩增产物的纯化及酶切 PCR扩增产物的纯化按说明书进行,使用OLIGO 6.0软件分析扩增产物酶切位点情况,选取Xmn I作为本研究使用的限制性内切酶。酶切反应体系:10×酶切缓冲液2 μL,Xmn I 0.5 μL,PCR扩增产物10 μL,补ddH2O至20 μL,37 ℃保温3 h,2%琼脂糖凝胶电泳观测结果。

1.2.5 SSCP分析 5 μL扩增产物或酶切产物与5 μL变性液(5 mmol/L EDTA,0.5 g/L溴酚兰,0.5 g/L二甲基苯青,95%甲酰胺)混匀,沸水浴5 min,迅速置于冰上。取2 μL处理产物上样于8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳。电泳条件:电泳槽置于4 ℃,1×TBE,100 V 4 h。电泳结束后进行银染染色并扫描。

2结果

2.116S rDNA基因的通用引物PCR扩增结果

利用16S rDNA基因的通用引物扩增4种食源性致病菌,结果均在370 bp处得到清晰条带,如图1所示。

2.2PCR产物酶切结果

4种致病菌16S rDNA保守区段的扩增产物经Xmn I酶切后,结果见图2。从酶切谱图可以看出,本试验所研究的4种致病菌谱带极为相似,具有很高的同源性。

2.3SSCP分析结果

16S rDNA扩增产物直接SSCP分析结果显示,蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌SSCP图谱非常相似,如图3所示。16S rDNA扩增产物经Xmn I酶切后的SSCP图谱能够很好地区分大肠杆菌、沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌及金黄色葡萄球菌,如图4所示。

3 讨论

食源性致病菌常用的检测方法就是选择培养基培养和生化鉴定,鉴定过程需要很长时间,而最终的鉴定结果也不一定准确,往往会错失病情控制的时机。本研究通过PCR扩增产物及其Xmn I酶切产物的SSCP分析研究得知,PCR扩增产物的直接SSCP分析不能很好地区分大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌,而PCR产物经Xmn I酶切后的SSCP分析能够清楚地鉴定上述4种常见食源性致病菌。本研究结果显示,当核酸片段小于250 bp时SSCP分析更利于区分大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌。以上结果说明,PCR产物酶切后的SSCP分析技术可以方便地用于检测食源性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌。

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9.病毒检测和网络安全漏洞检测制度篇九

为保证我校校园网的正常运行，防止各类病毒、黑客软件对我校联网主机构成的威胁，最大限度的减少此类损失，特制定本制度：

1、各接入单位计算机内应安装防病毒软件、防黑客软件及垃圾邮件消除软件，并对软件定期升级。

2、各接入单休计算机内严禁安装病毒软件、黑客软件，严禁攻击其它联网主机，严禁散布黑客软件和病毒。

3、网管中心应定期发布病毒信息，检测校园网内病毒和安全漏洞，并采取必要措施加以防治。

4、校园网内主要服务器应当安装防火墙系统，加强网络安全管理。

10.病毒检测软件的作用原理篇十

1.严密监控内存RAM区

对RAM的监控主要包括三个方面：

（1）跟踪内存容量的异常变化

内存容量由内存0000:004BH处的一个字单元来表示。正常情况下，该处的一个字表示以K为单位的内存容量。例如，如果内存容量为512K，则该字的内存为0200H，如果内存容量为640K，则该字的内容为0280H。由于系统型病毒在侵入系统后，一般都要对内存容量进行修改，以便保护其放在内存高端的病毒程序不被其他程序或COMMAND.COM文件的暂驻部分所覆盖。

因此，如果软件检测到内存容量发生了某些异常变化，通常是容量被无端占用，大幅度缩容，则表明有病毒存在。

（2）对中断向量进行监控、检测

此原理与病毒报警软件有关部分相同。

（3）对RAM区进行扫描

利用检测软件中所储存的大量病毒特征值，对RAM区中的所有字符串进行扫描，

如果发现RAM中的某些字符串与已知病毒的特征值字符串相同，则表明内存中已驻留了这种病毒，应立即采取措施。

2.监控磁盘引导扇区

系统型病毒主要维护引导扇区，对引导扇区的严格监控，可以有效检测出系统型病毒。

（1）代码和有变，则可能有病毒感染。

由DOS的各种版本格式化后磁盘引导扇区的内容都是固定的，所以其代码和也是固定的。检测软件在求出代码和后，如果发现其结果与DOS版本的正常代码不一致，就可以初步确定被检测的磁盘引导扇区被病毒所感染。

此方法有其局限性，通常它需结合其他方法才能做出最终判断。

（2）扫描引导扇区的所有字符串

若发现有病毒特征值字符串出现，则可以判定有病毒存在于引导扇区。

（3）全方位扫描磁盘文件

检测软件对系统中的所有文件进行扫描，查找病毒特征值字符串，以确定是否有病毒被检测出。

11.猪流感病毒分子检测技术研究进展篇十一

关键词：猪流感；流行现状；分子检测

中图分类号： S858.28；S852.65+1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0059-02

收稿日期：2013-12-09

基金项目：国家科技支撑计划（编号：2012BAD04B01-5）。

作者简介：张文慧（1977—），女，吉林桦甸人，博士，副教授，从事微生物学研究。E-mail：215267612@qq.com。

通信作者：钱爱东，从事微生物学研究。Tel：（0431）84533426；E-mail：qianaidongO115@163.com。猪流感（swine influenza，SI）是由猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）引起的一种急性、高度接触传染性猪传染病。1918年，美国首次报道了SI。1930年，Shope分离并鉴定了第一株猪流感病毒SIV A/Swine/Iowa/15/30（H1N1），该病毒被认为是美国20世纪初发生的SI病原[1]。该病传播迅速，往往2～3 d内波及全群。康复猪、隐性感染猪是猪流感病毒的主要储存宿主，也是猪流感的主要传染源[2]。该病一年四季都可发生，在规模化养猪场难以根除，对养猪业危害极大。另外，SIV的HA受体结合位点具有与人流感病毒、禽流感病毒2种流感病毒受体相同的结合特异性，这决定了SIV不仅可以感染猪，同时也可感染人类[3]。历史上SIV感染人的报道并不罕见。1976年美国新泽西州一名士兵死于古典H1N1 SIV感染，这是人类历史上首例SIV致死人的报道，之后在其他地区也出现SIV感染人并致死的报告[4-5]。迄今为止，猪流感已遍及世界各地，已经分离出H1N1、H1N2、 H2N3、H3N1、H1N7、H3N3、H4N6、H5N1等多种血清型，其中在猪群中广泛流行的猪流感病毒主要有古典猪H1N1毒株、类禽H1N1毒株、类人H3N2毒株[6]。本研究对猪流感病毒的分子检测技术以及猪流感在我国的流行现状进行综述，旨在为开展猪流感研究提供参考。

1猪流感病毒分子检测技术研究进展

1.1反转录聚合酶链式反应

反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是目前发展最成熟的分子诊断技术，可以从基因水平检测SIV的RNA，大大缩短了SI病原的检出时间，为猪流感的快速诊断提供了更敏感、更快速的方法。该方法具有省时、省力、灵敏度高、特异性强、诊断速度快等优点，已在猪流感病毒检测中得到广泛应用[7]。Lee等利用RT-PCR方法分别在临床样本中鉴定出H1、H3、N1、N2亚型猪流感病毒[8]。杨焕良等建立了猪流感病毒H1N1、H1N2、H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法，可以在2个反应体系中对猪流感HA、NA基因进行亚型鉴定，极大地节约了人力与时间[9]。特异性试验检测多重RT-PCR不能扩增其他猪病毒核酸，核酸最低检测量达2 ng。

1.2实时荧光定量PCR

實时荧光定量PCR（real-tmie flurescent quantitive polymerase chain reaction）是将荧光基团加入PCR反应体系中，利用荧光信号积累对整个PCR进程进行实时监测，敏感性远远高于普通的RT-PCR。实时PCR/RT-PCR技术是将PCR、核酸杂交、信号放大相结合的实时、在线检测的定量PCR技术，比常规PCR更灵敏、特异性更强。目前已被广泛应用于基因表达研究、转基因研究、药物疗效分析、病原体检测等诸多领域。此方法已被用于A型、B型流感病毒检测，检测流感病毒的M 基因、HA基因来区别A型、B型流感病毒，或是用于区别A型流感病毒的亚型[10-11]。段廷云等建立了实时荧光定量PCR检测H1N1亚型猪流感病毒，以NP基因的阳性重组质粒为荧光定量PCR标准品模板建立标准曲线。对探针浓度、引物浓度、镁离子浓度、退火温度进行优化，建立最佳荧光定量PCR反应体系、扩增程序[12]。荧光定量PCR的建立为早期诊断猪流感病毒、定量分析猪流感病毒感染程度奠定了基础。张太翔等选取猪流感病毒的NP基因序列设计引物、探针，建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法[13]。张鹏超等建立的猪流感病毒SYBR Green Ⅰ定量RT-PCR 检测方法对SIV核酸检测灵敏度达30 TCID[14]。陈艳等建立了H3N2亚型猪流感病毒实时荧光定量PCR快速检测方法[15]。徐敏等建立了以RNA为反应模板的一步法荧光定量RT-PCR诊断方法，该方法操作简单，可以用RNA作为模板直接检测，节省时间，特异性好，灵敏度高[16]。张春明等根据猪流感病毒（SIV） M 基因的保守序列，设计并合成1对特异性引物及TaqMan MGB 探针，建立了SIV M 基因实时荧光定量PCR 检测方法，结果表明，该方法样品检测与病毒滴定及病毒分离结果的符合率均达到100%，特异性强，重复性好[17]。Real-Time PCR技术能精确检测样品中SIV的含量，对SI临床检测诊断具有较强的实用价值[18]。

1.3基因芯片

基因芯片技术指将大量探针分子固定于支持物后，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号强度而获取样品分子的数量、序列信息。通过设计不同的探针阵列，使用特定的分析方法，可将该技术用于基因表达检测、突变检测、多态性分析、基因文库作图、杂交测序、微生物检测等领域[19]。陈红军等根据流感病毒血凝素、神经氨酸酶、亚型基因序列间的差异性，分别设计H1、H3、H9、N1、N2的特异分型引物，根据M基因设计A型流感病毒的通用引物制成基因芯片，并对217 份不同地区的样品进行检测，结果表明，该芯片可以同时检测待检样品中5种亚型A型流感病毒，并显示了较高的灵敏度、特异性，灵敏度比PCR 高1个稀释度，比病毒分离高2个稀释度[20]。杨林等根据猪流感病毒的M基因序列设计了1对特异性引物，通过将单链PCR产物与芯片杂交实现对SIV的检测[21]。高淑霞等制备了检测H1N1、H3N2、H5N1、H9N2 4种亚型猪流感病毒的基因芯片技术，与PCR方法相比，该基因芯片技术显示了较高的灵敏度[22]。王慧煜等建立了能同时鉴别甲型H1N1及猪流感病毒常见亚型的新型基因芯片检测方法[23]。

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2我國猪流感流行现状

近年来，我国很多学者分离到不同亚型的SIV[24]。李海燕等对黑龙江省、吉林省、辽宁省等地猪群进行了猪流感血清学、病原学调查研究，从1 306份猪鼻棉拭子样品及死亡猪肺、气管样品中分离到39株H3N2 亚型猪流感病毒、12株H1亚型猪流感病毒及其他亚型猪流感病毒[25]。辛晓光等进行了黑龙江省猪流感病原学及血清学调查，1997—2002年共采集到414份猪血清样品，经猪流感血清学检查出猪流感阳性血清57份，平均阳性率为14%；采集到猪的病毒材料275例，经技术处理后接鸡胚，分离出猪流感病毒26株，表明有些猪场污染情况比较严重，直接影响猪场的生存及发展[26]。王隆柏等于2005年8—12月对福建省猪群猪流感病毒感染情况进行调查，猪流感H1亚型抗体检测的平均阳性率为530%，猪流感H3亚型抗体检测的平均阳性率为23.7%，由此可知，福建省猪群不仅存在不同程度的H1、H3亚型SIV感染，而且感染较为普遍[27]。康文彪等在甘肃省11个市州的猪群中检出猪流感H3N2抗体阳性118份，平均阳性率为2789%，其中健康猪血清检出阳性42份，阳性率为2234%；患病猪血清检出阳性76份，阳性率为32.34%[28]。朱善德等对浙江省宁波市10个县（市、区）5个猪场的457份血清进行猪流感H3N2抗体检测，结果表明，猪场阳性率为2593%，全市猪群平均阳性率为16.41%；检测健康猪血清373份，阳性率达11%；检测发病猪血清84份，阳性率达4048%[29]。姚敬明等2010年6月至2011年11月在山西省采集了1 018份血样，用ELISA试剂盒检测猪流感血清抗体，阳性率为0.98%[30]。禹思宇等2010年6月采用间接ELISA及实时荧光RT-PCR技术，对湖南省规模化猪场采集的 1 065 份猪血清、16 796份猪棉拭子、360份肺脏样品进行检测，结果显示，SIV H1N1抗体阳性率达37.84%，H1N1猪流感病毒抗原阳性率为0.12%[31]。由此可知，SIV在我国不同地区均呈现地方性流行趋势，猪群普遍受H1亚型、H3亚型SIV感染。

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