体外诊断试剂检查性激素常识

体外诊断试剂检查性激素常识

1.体外诊断试剂检查性激素常识 篇一

关键词：双酚A,雌激素,孕酮,孕激素受体,米非司酮

双酚A是一种酚类环境内分泌干扰物,广泛应用于食品和饮料的碳酸聚酯包装材料、金属罐头的树脂内膜、牙齿固封剂,及其他产品的添加剂[1]。近些年有关双酚A雌激素作用的报道逐渐引起人们的高度重视[2],但有关双酚A能与孕激素受体绑定,影响孕激素信号通路,进而造成胚胎着床失败的研究国内外尚少,本试验在前期试验基础上,利用Ishikawa细胞模型,以已知抗孕激素RU486为参照,研究双酚A的抗孕激素样作用。

1 材料与试剂

人类子宫内膜上皮腺癌Ishikawa细胞:购自英国索尔兹伯里市的欧洲细胞株/微生物保藏中心。双酚A、4-壬基酚、17β-雌二醇、乙烯雌酚、乙醇购自Sigma公司;Trizol、M-MLV逆转录酶、FAM探针、RT-buffer、PCR-Mix、Marker购自Invitrogen公司;BCA试剂盒、PR抗体购自Roche公司。

2 方法

2.1 Ishikawa细胞培养

Ishikawa细胞以每毫升50 000个细胞的浓度接种于6孔培养板中,5%胎牛血清的DMEM培养液,5%CO2、37℃饱和湿度下培养72h,至亚融合状态后添加17β-雌二醇(10-7M)继续培养72h,致细胞处于PR上调性表达期,随后不同浓度孕酮单独干预;不同浓度RU486、双酚A与孕酮(固定浓度,10-7M)混合干预培养48h。

2.2 定量逆转录聚合酶链反应(RT-q PCR)法检测PRmRNA表达

按Trizol试剂盒说明提取总RNA,采用紫外分光光度法检测吸光度(A)值,鉴定RNA的纯度和量。所用RNA的A260/A280均在1.8~2.0。逆转录反应(RT)得到c DNA,采用实时荧光定量PCR检测PRmRNA表达情况,上游引物为:5'-TTTAAGAGGGCAATGGAAGG-3',下游引物为:5'-CGGATTT-TATCAACGATGCAG-3',运用Light Cycler480相对定量分析软件1.5,设G6PDH为标准内参基因对q PCR结果进行标准化校准,扩增时的Cq值代表目的基因的相对表达量。

2.3 Western Blotting法检测PR蛋白表达

收集细胞,用磷酸缓冲液(PBS)清洗3次。加入适量细胞裂解液冰上摇晃20min,20500(r/min)离心10min,取上清。BCA法测定蛋白浓度。10%分离胶,5%浓缩胶SDS-聚丙烯酸胺凝胶(SDS-PAGE)上样电泳。半干法,恒流100m A,转膜1.5h。室温摇床封闭2h,一抗4℃过夜,次日二抗孵育2h,辣根过氧化物酶HRP-ECL发光显色,最后分析与扫描,GAPDH为标准内参蛋白,进行标准化校准。

2.4 统计学方法

应用SPSS 15.0软件进行数据处理。计量资料以±s表示,组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。以四参数Logistic模型分析为基础,通过非线性回归对细胞浓度—效应关系进行分析,并建立S函数量效曲线。

3 结果

3.1 各物质干预下PRmRNA的表达

孕酮干预下细胞内PRmRNA呈下调性表达。见图1。而双酚A和米非司酮一样,可浓度依赖性的拮抗PRmRNA下调表达,且双酚A能建立与米非司酮类似的S函数量效曲线。见图2。

3.2 各物质干预下对PR蛋白表达的影响

Western Blotting结果显示:与17β-雌二醇干预组相比,孕酮干预下PR蛋白表达减少,差异有统计学意义(P<0.05);双酚A、米非司酮干预下PR蛋白表达增多,与孕酮干预组相比差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。见表1。

注:与雌二醇组比较,*P<0.05;与孕酮组比较,#P<0.05

4 讨论

人类正常的胚胎着床是雌、孕激素通过其受体对子宫内膜进行调节而实现的。胚胎着床时,雌激素水平下降,孕激素浓度升高,进而对PR起降调作用,使子宫内膜在胚胎着床期呈现最大限度的可容受性。而PR的下调启动了子宫内膜的功能分化及分泌蛋白的产生[3]。双酚A是具有代表性的环境雌激素化学物,其可影响子宫内膜雌激素受体表达,干扰雌激素的合成代谢。目前,许多动物实验都发现双酚A在高剂量情况下能干扰正常的胚胎着床[4~6],且一份最新研究表明试管婴儿(IVF)患者尿道双酚A水平和妊娠失败相关[7]。但这些体外试验的结果均与双酚A的雌激素作用相关。

近期Dassen等发现双酚A还能与孕激素受体结合,干扰小鼠的正常着床。本实验结果显示双酚A能拮抗孕酮对孕激素受体的下调表达,并能产生与已知抗孕激素类药物米非司酮类似作用的S函数量效曲线。抗孕激素药物米非司酮通过阻断孕酮作用,使妊娠蜕膜变性、出血、坏死,直至流产。本实验结果说明了双酚A具备抗孕激素样作用,并可通过拮抗孕激素的正常功能进而造成子宫内膜激素水平异常,从而干扰正常的胚胎着床。

本实验选取的人类子宫内膜Ishikawa细胞,功能性雌激素受体和孕激素受体均能在该细胞内较好的表达,且已广泛应用于有关激素样化学物的研究[8]。本实验前期工作发现,在17β-雌二醇的干预下PR能够稳定上调表达。这些特点使得Ishikawa细胞成为研究激素样化学物对PR影响的理想模型。

总之,在本实验子宫内膜细胞模型中,证明了双酚A能产生抗孕激素样作用。同时,从预防角度出发,本结果认为针对双酚A与孕激素受体之间相互作用的观察,应该成为探讨环境内分泌干扰物对人类、动物生殖毒害的重要组成部分。

参考文献

[1] Richter CA,Birnbaumb LS,Farabollini F,et al.In vivo effects of bisphenol A in laboratory rodent studies[J].Reprod Toxicol,2007,24:199-224.

[2] Kang JH,Kondo F,Katayama Y.Human exposure to bisphenol A[J].Toxicology,2006,226(2/3):79-89.

[3] Stroki T,Germeyer A,Popovici R,et al.The human endometrium as a fertility-determining factor[J].Hum Reprod Update,2006,12:617-630.

[4] Berger RG,Hancock T,Decatanzaro D.Inuence of oral an subcutaneous bisphenol-A on intrauterine implantation of fertilized ova in inseminated female mice[J].Reprod Toxicol,2007,23:138-144.

[5] Berger RG,Shaw J,Decatanzaro D.Impact of acute bisphenol-A exposure upon intrauterine implantation of fertilized ova and urinary levels of progesterone and 17β-estradiol[J].Reprod Toxicol,2008,26:94-99.

[6] Berger RG,Foster WG,Decatanzaro D.Bisphenol-A exposure during the period of blastocyst implantation alters uterinemorphology and perturbsmeasures of estrogen and progesterone receptor expression in mice[J].Reprod Toxicol,2010,30:393-400.

[7] Enrlich S,Williams PL,Missmer SA,et al.Urinary bisphenol A concentrations and implantation failure among women undergoing in virtro fertilization[J].Environ Health Perspect,2012,120(7):978-983.