实时荧光定量PCR研究进展及其在中药领域的实践的论文

实时荧光定量PCR研究进展及其在中药领域的实践的论文（共5篇）

1.实时荧光定量PCR研究进展及其在中药领域的实践的论文 篇一

实时荧光定量PCR检测限的统计推断

来源：中国论文下载中心

作者：王文清，王昌富，袁琳，彭长华，常武

【摘要】 检测限是检测方法的重要性能指标，用Poisson分布的概率函数分式计算一次抽样检测出现的结果推论总体出现该结果的概率。以实时荧光定量PCR(FQPCR)检测乙型肝炎病毒DNA结果为例，计算可知，一次抽样反应管的检测结果≥4时，才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而检测血清中病原体时扩增反应管中的检测限是4拷贝/ul计算也可知，1拷贝/ul表示一次抽样的结果为0的概率可达0.368，结果在0拷贝/ul～4拷贝/ul的概率为0.996，而1000拷贝/ml表示一次抽样结果为0的概率为0。结果在905拷贝/ml～1 095拷贝/ml的概率为0.997；而100 000拷贝/L表示一次抽样结果在997 000拷贝/L～1 003 000拷贝/L的概率为0.997。抽样单位ul不能随意放大为ml甚至L。

【关键词】 实时荧光定量PCR；检测限；统计推断

Statistical Conclusion of Limit of Quqntitation in Realtime Fluorescence Quantitative PCR

Abstract:Limit of quantiation is a important performance index of assay methods.Results of sample drawing are calculated through possiblity function equation of Poisson distribution,then the possibility of results emerged in population is deduced.For example,in Realtime Fluorescence quantitaive PCR to assay HBV DNA,only when sample drawing results≥4,significance of difference(P<0.05)could be deduced between population and blank.So limit of quantitation is 4 copies/ul denoting 0 in one sample drawing is 0,and Possibility of results between 905 copies/ml to 1095 copies/ml is 0.997.Possibility of 100 000 copies/L denoting results between 997 000 copies/L to 1 003 000 copies/L in one sample drawing is 0.997.Sample drawing unit ul could not be replace by ml or L.Key words：Realtime Fluorescence quantitative PCR；Limit of quantitation;Statistical conclusion

检测限是检测方法的重要性能指标，只有在检测报告中明确表达了检测方法的检测限，该检测报告在各实验间及同一项目的各种检测方法间才可进行比较。能检测到的最低分析物浓度为检测系统的检测限。当前，检测限术语混乱，如：灵敏度(sensitivity)、分析灵敏度(analllytical sensitivity)、定量限度(limit of quantitqtion)等［1］。每个词语的实际含义中包含有各自的实验方式、数据处理方式及由数据作出的推论等。我们采用统计学方法，以期得到一致的实时荧光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQPCR)检测限，现介绍如下。

文献中FQPCR检测限的描述

检测乙型肝炎病毒DNA的文献中检测限使用了“最低检出量”［2，3］、灵敏度［5～7］等术语，它等于已知的高拷贝HBV DNA血清10倍系列稀释后能检测到扩增曲线的最大稀释倍数管浓度。表述有：阴性HBV DNA≤106拷贝/升［4］；荧光定量PCR法检测灵敏度102拷贝/ml［5］、104拷贝/ml［6］、8.6×102拷贝/ml［7］；HCⅡ法检测灵敏度1.4×105拷贝/ml［7］；103 Eq/ml理论值时到达检测极限［3］；PCRFP检测HBV DNA的最低检测出量1×101拷贝［2］；bDNA在105 Eq/ml时到达检测极限［3］。以上检测限术语各不相同，且同一方法检测HBV DNA在上述各实验室发出同样的“HBV DNA低于检测下限”的报告时其实际HBV DNA拷贝数相差可达100倍。

FQPCR检测过程简介

以测定血清乙型肝炎病毒DNA为例：将40 μl血清样本加40 μl DNA提取液处理后，将其中2 μl（相当于1 μl血清）加入主反应液（含DNA引物、酶、DNA构件分子dNTP等）管中，在自动热循环上进行温度循环，自动热循环仪记录每一反应管在每一次温度循环的荧光强度，记30次温度循环后结束。在PCR循环过程中，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数称为Ct值（Cyclethreshold),它与反应管中DNA起始拷贝数的对数值（lgN)呈非常显著的直线相关关系。自动热循环仪对标准样品自动生成一条Ct值对于起始拷贝数值（lgN)的工作曲线，并通过该工作曲线来确定待测未知样品反应管的起始拷贝数（N）。当30次循环后某一待测管仍检测不到高于基线水平的荧光信号时，仪器默认Ct值为30，不计算起始拷贝。确定FQPCR检测限的统计学原理

如果被检物的含量和检测方法的空白响应量的波动服从正态分布规律，则检测限可用多次检测空白的方法来确定。可信限为95%时检测限＝x空白+2.s空白；可信限为99.7%时检测限=x空白+3.s空白。这是目前多数检测限的确定方法。对核酸检测方法的检测限的理解可能与此有差别，但是原理应是一致的［1］，FQPCR检测限也应是推论总体与空白有统计学差异的最小抽样结果。

FQPCR检测限的统计推断

假设病原体在血液等体液中的分布是随机的，则单位体积中(如1.0 μl)病原颗粒数的分布服从Poisson分布。以Poisson分布的概率函数公式计算一次抽样检测出现的结果推论总体概率。从理论上来说，使用PCR测定技术测定病原体核酸序列的量可低至1个拷贝［2］。例如：血清标本中加入等量的DNA提取液，于离心管中煮沸，4 ℃放置，离心，吸取上清液2 μl作模板 进行扩增检测(2 μl上清液相当于抽样1 μl血清)［2］，其中至少有1个拷贝的HBV DNA才能有典型扩增反应，这时检测结果是1拷贝/μl。由Poisson分布的概率函数公式可计算出1次抽样检测结果出现0时，推断总体为1～9的概率见表1。

表1 总体为1～9时抽样为0的概率及总体（略）

在FQPCR检测HBV DNA中，当30次循环后某一待测管仍检测不到高于基线水平的荧光信号(即当Ct≥30)，反应管检测结果为0时，推论总体拷贝数为1～9的概率之和>0.581 92，总体为其他的概率之和<0.5(此时报告0拷贝的可信限度低于50%)。总体为1时一次抽样结果分别为1～9时的概率见表1。当一次抽样结果≥4时，推论总体为1的概率≤0.015 33，所以对于病原体的检测，一次抽样反应管检测结果≥4拷贝时，才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而上述检测血清中病原体时一次抽样反应管的检测限是4拷贝/μl。当总体为1、2、3时一次抽样结果为0的概率分别是0.367 88、0.135 34、0.049 79。如室间质量评价样本靶值选择1拷贝/μl、2拷贝/μl、3拷贝/μl时，无论实验室实际检测质量如何高，都将有36.79%、13.53%、4.98%的实验室检测结果为0而被判为不符合［按靶值的对数值GM±0.5 log(10)［9］作为可接受的定量范围］。2005年卫生部室间质量评价中靶值为1.51拷贝数/μl的样本符合率仅35.2%；Mancini C 等［9］报道一些实验室对检测下限附近的样本(3.00 log IU/ml)准确定量有困难；Raggi CC等［10］也报道28.6%的实验室(12/42)对最低浓度的样本不能定量。这些都是因为检测下限附近的样本一次抽样结果为0的概率太大所致，对此我们将另文详细讨论。造成上述文献中检测限差异较大的可能原因如下：用于10倍系列稀释的已知高拷贝HBV DNA血清本身拷贝数的差异；对检测限的理解差异，由一次抽样没能检测到典型扩增的稀释血清管推论总体浓度为0的可信度太低(<50%)；抽样单位的任意放大：在上述HBV DNA检测中，抽样单位是1 μl血清［如血清前处理过程中有抽提(浓缩)过程，取2 μl上清液相当于实际含12.5 μl血清，则抽样单位也只是12.5 μl］，而报告结果的单位是ml甚至L。当总体为1拷贝/μl时表示一次抽样结果为0的概率达0.368，结果在0拷贝/μl～4拷贝/μl的概率为0.996；而总体为1 000拷贝/ml时表示一次抽样结果为0的概率为0，结果在905拷贝/ml～1 095拷贝/ml的概率为0.997(Poisson分布总体>50时近似正态分布，范围是X±uα*√X，可信限为99.7%时uα=3);总体为100 000拷贝/L时表示一次抽样结果在997 000拷贝/L～1 003 000拷贝/L的概率为0.997。文中推理以HBVDNA的FQPCR检测为例，其他病源体核酸的FQPCR检测也与其相同，检测限是抽样反应管的检测限4拷贝/反应管；如反应管中加入模板量相当于12.5 μl血清则检测限相当于0.32拷贝/ μl。此推断仅是针对FQPCR技术本身的检测限度，未就临床上有意义的最小病源体核酸的拷贝数进行讨论。【参考文献】

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2.实时荧光定量PCR研究进展及其在中药领域的实践的论文 篇二

传统的细菌分离、培养、鉴定的方法费时费力而且准确性较低, 于是人们开始致力于新方法的研究, 实时荧光定量P C R作为P C R技术中的一种用于微生物检测有着快速、有效、准确性高等优点, 已经广泛应用于该领域中。

实时荧光定量P C R技术[2,3]是在1 9 9 6年由美国的A p p lie d B io s y s te m s公司首先推出的。它在传统P C R的反应中加入了荧光基团, 并连续监测荧光信号出现的先后顺序和强弱程度的变化, 从而分析得到目的基因的初始量, 再与已知量的标准品进行比较而实现实时荧光定量。实时荧光定量P C R是在传统P C R基础上发展起来的新技术, 实现了P C R从定性到定量的跨越, 有着更加快速、灵敏度特异性更强、准确并可实时监测等优点, 在微生物检测等领域得到了广泛应用[4]。本文介绍实时荧光定量P C R技术在几种常见的食品致病菌检测方面的应用。

1 金黄色葡萄球菌的检测

金黄色葡萄球菌作为人畜共患病的一种是引起食物中毒的常见致病菌。它以引起化脓性感染为主要特征, 如疖、痈、创伤局部感染以及肺炎、脑膜炎、心内膜炎等全身性感染, 已成为危害人类健康重要因素之一。实时荧光定量P C R技术在检测金黄色葡萄球菌时, 相较传统方法具有较高优势。苏明权等[5]利用金黄色葡萄球菌的fe m B基因序列设计引物和探针。用基因重组技术成功建立了金黄色葡萄球菌实时荧光定量P C R方法和金黄色葡萄球菌重组质粒标准品。通过模拟感染实验验证得出与传统方法符合率为1 0 0%。刘继超等[6]以金黄色葡萄球菌肠毒素A为靶基因设计引物和T a q M a n探针, 从而建立的对金黄色葡萄球菌肠毒素A的快速检测方法, 具有较高的特异性和灵敏度。李丹丹等[7]根据S a 4 4 2基因序列设计合成引物及T a q M a n探针, 建立了实时荧光定量P C R快速检测金黄色葡萄球菌的方法。并利用该方法检测1 7 5份样品, 阳性率与国标法一致, 显示了较高的灵敏度与特异性。实时荧光定量P C R技术的快速发展, 为食品中金黄色葡萄球菌的检测提供了更多的手段。

2 沙门菌的检测

沙门菌主要通过污染水和食品而感染动物和人类, 从而引胃肠炎、菌血症或败血症、伤寒和副伤寒等疾病。传统检测沙门菌的方法大约需要4~7 d, 耗时而且费力。因此实时荧光定量P C R技术因其优势被广泛应用于食品沙门菌的检测中。耿蕊等[8]用S Y B R G r e e nⅠ荧光定量P C R方法扩增沙门菌的i nv A基因片段, 以达到快速检测沙门菌的目的, 并实验证明其具有极强的特异性。曹冬梅等[9]根据G e nB a n k所公布的伤寒沙门菌的基因序列设计引物和T a q m a n探针, 对含有非沙门菌、伤寒沙门菌、和其他血清型沙门菌共6 5株菌株进行检测, 鉴定出了全部的3 1株伤寒沙门菌, 与传统方法结果一致。程洁萍等[10]建立的T a q M a n探针实时荧光定量P C R快速检测奶粉中沙门菌的方法, 只需要4 0 m in即可完成检测, 大大提高了食品安全风险监测的速度。

3 志贺菌的检测

志贺菌可分为痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍特志贺菌和宋内志贺菌4个血清群, 可引起人类细菌性痢疾, 严重危害人类健康。李丹丹等[11]以志贺菌高度保守的ip a H基因序列为目的基因设计引物探针, 建立了快速检测动物源性食品志贺菌的方法。以此方法对2 0 5份样品进行检测, 结果国标方法一致。郭瑜等[12]同样以志贺菌的ip a H基因为目的基因进行扩增, 建立的快速检测乳中志贺菌的方法, 特异性和灵敏度都极强。乳中2.8 4 c fu/m l的志贺菌都可被检测出。为志贺菌的快速检测提供了一种新的手段。

4 单核细胞增生李斯特菌

单核细胞增生李斯特菌是一种革兰阳性短小杆菌, 其分布非常广泛, 在土壤、水、人畜粪便中均可检测到该菌的存在, 还可污染奶制品。该菌经粪-口传播, 主要引起单核细胞增多, 也可引起菌血症、脑膜炎等疾病, 是危害程度很高的一种人畜共患病。如何快速有效的检测单核细胞增生李斯特菌成为研究热点。李丹丹等[13]以单核细胞增生李斯特菌ia p基因为靶基因, 建立了实时荧光定量P C R快速检测该菌的方法, 利用该方法检测1 3 9份样品, 检出3份阳性样本, 与国标法结果一致。闫琳等[14]通过检测单核细胞增生李斯特菌的h ly A基因, 建立了快速检测猪肉中该菌的实时荧光定量P C R方法, 该方法快速、准确, 完全适应于大量样品的检测。

5 大肠埃希菌

大肠埃希菌是常见的革兰阴性无芽胞杆菌, 可引起人类泌尿系感染、菌血症、肺炎等肠道外感染。该菌是人类肠道正常菌群, 可其中也有可引起腹泻的菌株, 包括肠毒素型大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌、肠侵袭型大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌、肠凝聚型大肠埃希菌五种, 危害性较大。胡朝友等[15]建立的实时荧光定量P C R法快速检测食品中大肠埃希菌方法, 相较传统方法更快速灵敏, 非常适用于大批量食品样的检测。张建华等[16]以大肠杆菌O 1 5 7:H 7的f b E r基因为目的基因设计引物和T a q M a n探针, 建立了实时荧光定量P C R快速检测大肠杆菌O 1 5 7:H 7的方法。为食源性疾病提供了新的检测手段。

3.实时荧光定量PCR研究进展及其在中药领域的实践的论文 篇三

在人乳头瘤病毒感染的型别中, HPV16亚型 (鳞癌) 是公认的致癌高危型。国内外研究表明, 高危型HPV病毒持续感染会让患宫颈癌的危险性增加[2]。通过RT-PCR技术对鳞癌基因检测, 可提早发现宫颈癌前病变。

本研究通过采用实时荧光定量PCR技术, 对本院120例宫颈病变患者HPV16 mRNA进行监测, 分析判断HPV16m RNA表达在宫颈癌及癌前病变诊断中的作用, 拟建立HPV16的实时荧光定量PCR检测方法学。

1 材料与方法

1.1 标本收集

样本来源于2006～2012年四川省人民医院城东病区医院病理科档案中的甲醛固定石蜡包埋组织共计120例, 包括宫颈癌、宫颈上皮内瘤变 (CIN) 及宫颈炎组织。

1.2 试剂和设备

HPV16引物和β-action引物序列见表-1.RT-PCR反应试剂盒 (大连TaTk Ra) , 紫外分光光度计 (美国Beckman公司) , PCR扩增仪 (美国THermo公司) 。见表1。

1.3 指标检测

1.3.1 宫颈组织总RNA抽提

使用Trizol一步法提取宫颈组织细胞在患者病毒的HPV16 RNA, 用采用紫外分光光度法测定波长外总核糖核酸的浓度和纯度, 筛选了OD 260/od280之间的比例为1.8～2之间的样本, 计算每个样品浓度, 样品浓度都是混合成一个统一的50 ng/μL。

1.3.2 逆转录

逆转录严格按照试剂盒的说明, 抽提HPV16 RNA逆转录成c DNA。

1.3.3 RT-PCR

将HPV16选择为目的基因, 建立标准曲线, 得到样品中相应目的基因的Copy数;同时以管家基因β-actin作为内参建立标准曲线, 得到样品中管家基因的Copy数, 将Copy数进行校准 (分别来自目的基因和管家基因) , 最后得到的Copy数就是目的基因的定量。反应体系为95℃预变性5 min, 循环1次, 94℃变性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸2min, 循环35次, 72℃延伸7min, 循环1次, 4℃保存[3]。以上总反应体积为50μL (TaKaRa Ex Taq (5U/μL) 0.3μL、10×Ex Taq Buffer (Mg2+Plus) 5μL、dNTP Mixture 4μL、模板DNA 5μL、引物1、2 (20 pmol/ml) 2μL, 加DEPC处理水至50μL) 。

1.3.4 结果分析

反应结束后, 使用SDSW12.3软件分析PCR过程各检测样本的CT (Threshold cycle) 值。本研究通过2-△△CT计算HPV16mRNA表达水平:

以2-△△CT表示HPV16 mRNA表达差别倍数, PCR反应的特异性通过熔解曲线判断。

2 实验结果

2.1 RT-PCR溶解曲线分析

RT-PCR熔解曲线分析, 根据实验结果, 实验组HP V16和行动熔解曲线显示为一个单一的峰值, 熔化温度是85℃, 相同条件重复扩增, 获得HP V16和行动的熔化温度值是在约85℃, 不超过1℃, 扩增特异性产品, 见图1、图2。

2.2 HPV16 mRNA表达2-△△CT值

表2显示, HPV16mRNA在宫颈癌细胞中呈过表达。HPV16mRNA扩增曲线见图3。

3 讨论

PCR在体外酶促扩增DNA原理类似于天然DNA的复制机制, 主要是利用DNA聚合酶依赖DNA模板的属性, 模仿体内复制过程, 在附加的一对引物之间引发聚合, 合成引物序列为基础的扩增区域两侧边界DNA序列测定, 并分别与相对DNA链互补。荧光定量RT-PCR是借助于荧光检测PCR仪, 利用荧光信号积累, 在PCR反应体系中加入荧光基团, 对PCR过程中每一个循环产生的扩增产物进行实时监测, 从而对模板的初始浓度进行定量的方法。RT-PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃, 与常规普通PCR相比, 它具有更强的特异性、自动化程度高等特点, 而且有效解决PCR污染问题[4]。

注:与宫颈炎组比较, *P<0.05, **P<0.01

HPV感染非常普遍, 从高危型HPV感染进展为宫颈癌, 需8～10年的时间。治疗宫颈癌的关键是早期发现, 一期宫颈癌五年生存率可达93%, 二期大约为80%, 到了三期和四期就只有20%左右了。因此对患者进行HPV基因检测可早期发现宫颈癌前病变, 进行早期治疗, 预防宫颈癌的发生。因此, 对HPV16等进行实时荧光定量PCR检测对于临床判定宫颈病变性质、治疗和追踪随访方面起到重要作用。

以上结果表明本研究建立的实时荧光定量PCR方法用于检测HPV16结果可靠, 特异性强, 为临床分析和判断宫颈癌变性质和时期建立了重要的方法学。

摘要：目的 通过对120例宫颈病患者HPV16mRNA表达进行检测分析, 建立HPV16的实时荧光定量PCR检测方法学。方法 搜集2006～2012年四川省人民医院城东病区医院病理科档案中的甲醛固定石蜡包埋组织共计120例, 分为宫颈癌组、宫颈上皮内瘤变组及宫颈炎组, 通过实时荧光定量PCR技术对三类标本中HPV16表达进行检测。结果 与宫颈炎组比较, HPV16在宫颈癌组织和宫颈上皮内瘤变组织中呈强烈表达 (P<0.01) 。结论 本研究建立的实时荧光定量PCR方法用于检测HPV16结果可靠, 特异性强, 为临床分析和判断宫颈癌变性质和时期建立了重要的方法学。

关键词：宫颈癌,HPV16,实时荧光定量PCR,方法学

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4.实时荧光定量PCR研究进展及其在中药领域的实践的论文 篇四

近年来, 随着分子生物学的快速发展, 以PCR技术为基础发展起来的分子检测方法在病原物的检测中得到了广泛应用[1,2,3,4]。实时荧光定量PCR是一种实时监测扩增产物并进行解析的定量方法, 具有灵敏性高、重复性好、检测速度快、自动化程度高等优点, 目前已被国内外众多机构广泛应用于DNA及RNA表达水平的定量分析[5]。对病原物的定量分析通过对病原物内参基因的定量分析来实现, 通常选择表达量高且表达水平比较稳定的持家基因作为内参基因[6,7,8,9]。肌动蛋白是真核生物中分布最多的蛋白, 它被广泛作为内参基因用以研究基因的表达水平[10]。本研究中作者选取编码一种玉米黑粉菌肌动蛋白的βactin基因作为对黑粉菌进行实时荧光定量的内参基因。

本研究通过对玉米黑粉菌中βactin基因进行定量测定来检测受侵染的玉米叶片中黑粉菌菌量。利用导入玉米黑粉菌βactin基因的具浓度梯度p MD19 T-Simple质粒为标准品, 建立了玉米黑粉菌实时荧光定量PCR检测体系, 实现了玉米黑粉菌的快速、定量检测, 具有较强的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

供试玉米黑粉菌SG200由德国麻普研究所Regine Kahmann教授赠送。玉米自交系掖478由中国农业科学院作物科学研究所王晓鸣教授赠送。

1.1.2 试剂

DNA提取试剂盒EZgeneTMFungal g DNA Kit (Biomiga) ;PCR扩增试剂 (美国Thermo) ;胶回收试剂盒Agarose Gel DNA Purification Kit (日本Ta KaRa) ;T载体试剂盒p MD19 T-Simple (日本Ta KaRa) ;大肠杆菌感受态细胞Top10 (中国天根) ;质粒提取试剂盒 (美国OMEGA) ;其它试剂为国产分析纯。

1.1.3 仪器

实时荧光定量PCR仪CFX96 (美国伯乐) ;核酸蛋白检测仪Nano Drop ND-2000 (美国Thermo) ;电泳槽 (北京六一) ;凝胶成像系统 (美国伯乐) ;水浴锅 (中国振捷) ;摇床 (美国New Brunswick scientific) ;离心机 (美国Sigma) 。

1.1.4 培养基

(1) PDA (土豆200g/L, 葡萄糖20g/L, 琼脂粉15 g/L, 1%1mol/L Tris·HCl, p H=8.0) ; (2) YEPS (酵母提取物10g/L, 蛋白胨4 g/L, 蔗糖4 g/L) ; (3) LB培养基 (Na Cl 10 g/L, 蛋白胨10g/L, 酵母提取物5 g/L) 。

1.2 方法

1.2.1 玉米黑粉菌培养及玉米植株接种方法

挑取PDA上生长了5 d的单菌落置于5m L的YEPS中, 28℃、220r/min过夜培养。取100μL过夜培养液置于100m L YEPS培养基中, 28℃、200r/min培养至OD600为0.6~0.8。1 000×g离心5 min收集菌体, 用无菌水悬浮菌体2次, 最后用无菌水将菌体稀释为OD600=1.0。

将供试玉米按每盆2粒播种于5×5 cm的花盆中。在玉米2叶期, 用1ml注射器吸取黑粉菌菌悬液注射接种玉米茎秆基部, 直至菌悬液从玉米喇叭口溢出。对照样品注射无菌水。接种后的玉米置于24~35℃温室继续生长。分别于接种后1、3、7、10和20d剪取植株叶片, 液氮速冻后, 置于-80℃保存。同时取对照叶片用于引物的特异性检测。每个时间点取样5株玉米, 保留部分植株以观察接种反应型。

黑粉菌冬孢子于2013年9月下旬采集于陕西省杨凌区下川口村玉米地。

1.2.2 DNA提取

利用真菌DNA提取试剂盒试剂盒, 提取玉米黑粉菌冬孢子及黑粉菌侵染的玉米叶片总DNA。对于黑粉菌侵染的玉米叶片, 采用液氮研磨的方法破碎细胞。对于黑粉菌冬孢子, 采用液氮结合干冰的方法研磨样品。具体方法为:用液氮预冷研钵及研杵, 在研钵中加入灭菌的石英砂及干冰。用研杵将干冰捣碎后, 倒入黑粉菌冬孢子, 迅速研磨至干冰即将完全升华时, 加入试剂FG1。待气体完全排除后, 按说明书中操作步骤进行。利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量, 利用核酸蛋白检测仪进行DNA浓度和纯度测定。

1.2.3 引物设计及合成

根据Gen Bank中玉米黑粉菌的βactin基因序列 (XM_757271.1) , 利用Primer 5.0软件设计PCR引物, 并比对引物的特异性。上游引物序列为:5’CATGTACGCCGGTATCTCG3’, 下游引物序列为:5’CTCGGGAGGAGCAACAATC 3’, 扩增片段91bp。引物由上海捷瑞合成。

1.2.4 常规PCR反应体系及步骤

常规PCR反应体系25μL, 包含2.5μL 10×Buffer、2μL Mg Cl2 (25mmol/L) 、0.3μL d NTP (2.5 mmol/L) 、1μL上游引物 (10μmol/L) 、1μL下游引物 (10μmol/L) 、0.3μL Taq DNA Polymerase (5 U/μL) , 1μL DNA模板。PCR程序:94℃预变性4min;94℃变性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸30 s;40次循环。

1.2.5 PCR产物克隆

以βactin基因特异引物 (1.2.3) 对玉米黑粉菌冬孢子DNA进行扩增, 回收经琼脂糖凝胶电泳检测过的目的条带。按操作说明, 取回收的PCR产物与载体p MD19 T-Simple连接, 将连接产物转化大肠杆菌 (Escherichia coli) 感受态细胞。

1.2.6 菌落PCR鉴定及质粒提取

用牙签挑取白色单菌落于常规PCR体系中, 进行PCR扩增, 以检测是否有目标片段插入到载体中。反应程序同上。挑取阳性克隆, 接种于5m L含有氨苄青霉素 (100μg/m L) 的LB液体培养基。37℃、220r/min培养16h后按说明书提取质粒。

1.2.7 标准品的建立及实时荧光定量PCR反应体系与步骤

(1) 质粒定量:利用核酸蛋白检测仪对提取的质粒进行浓度测定, 并将其按照下列公式[11]换算成拷贝数。

(2) 质粒的稀释:吸取10μl质粒加入90μL灭菌超纯水中, 涡旋混匀, 从中吸取10μl质粒加入90μL灭菌超纯水中, 依次类推, 直到102拷贝/μL。

(3) 实时荧光定量PCR体系与步骤:

实时荧光定量PCR体系包含10μL Sso Fast Eva Green Supermix, 0.8μL上游引物 (10μmol/L) 、0.8μL下游引物 (10μmol/L) 、3μL DNA模板, 体系共20μL。PCR程序:94℃预变性3 min;94℃变性10 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共40次循环。扩增完毕后, 对熔解曲线分析以确定扩增产物的特异性, 温度范围65~95℃。所有试验样品均设3次重复。PCR扩增含未加模板对照, 以检验扩增的背景。

1.2.8 实时荧光定量PCR灵敏性检测

以50ng/μL的玉米黑粉菌DNA为起始溶液, 按10倍进行倍比稀释, 用优化好的实时荧光定量PCR反应体系进行检测, 以确定最低检测限。Ct值<35判定为阳性扩增, Ct值≥35判定为阴性扩增。

1.2.9 目标样本的检测

取接种后1、3、7、10及20d的玉米叶片DNA样品进行实时荧光定量PCR扩增, 用以该体系的实用性检测。

2 结果与分析

2.1 接种实验

用黑粉菌SG200菌悬液接种玉米自交系掖478, 接种后10d观察反应型。调查结果显示, 接种叶片及叶鞘上均产生明显菌瘤, 表明该黑粉菌和玉米自交系掖478组成亲和组合, 适于检测接种后不同时间点玉米的带菌量。

2.2 DNA质量检测

利用核酸蛋白检测仪测定样本DNA的A260/A280比值为1.7~2.0。经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 所有样品DNA条带清晰、整齐、无弥散, 表明DNA质量符合要求。图1为接种后3 d和10 d的玉米叶片总DNA及玉米黑粉冬孢子DNA电泳检测结果。

2.3 引物特异性分析

分别以接种玉米黑粉菌10d的玉米叶片DNA, 玉米黑粉菌冬孢子DNA及玉米叶片DNA为模板进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示 (图2) , 引物对接种叶片总DNA及黑粉菌冬孢子DNA扩增均能得到与目标片段大小相同的产物, 对未接种玉米叶片DNA无扩增产物产生。通过实时荧光定量PCR熔解曲线的分析 (图3) , 结果显示, 对接种玉米黑粉菌10d的玉米叶片DNA及玉米黑粉菌冬孢子DNA扩增产物在88℃有单一的熔解峰, 对玉米叶片DNA扩增无产物熔解峰出现。以上结果显示, 设计引物对SG200及来自大田的黑粉菌DNA均能产生扩增, 表明所设计引物扩增片段在不同黑粉菌中保守性强;该引物对未接种玉米叶片DNA未产生扩增, 表明该引物针对黑粉菌特异性强, 所以, 该引物可用于检测玉米叶片中的玉米黑粉菌含量。

2.4 实时荧光定量PCR标准曲线建立

利用玉米黑粉菌βactin基因的特异引物对玉米黑粉菌冬孢子DNA进行PCR扩增, 将扩增产物连接至p MD19 T-Simple载体。对重组质粒进行10倍倍比稀释, 以106~102拷贝/μL为模板在定量扩增仪上进行实时荧光定量PCR分析。利用CFX96TMManager软件, 以标准品拷贝数的对数值为横坐标, 以Ct值为纵坐标建立实时荧光定量PCR的标准曲线 (图4) 。所得标准曲线斜率为-3.823, 线性回归方程为y=-3.823x+39.086。标准曲线R2为0.996, 表明PCR扩增该标准品所得直线方程线性化程度高, 达到实时荧光定量PCR标准曲线的要求。

M, DNA分子质量标记;1, 接种黑粉菌3d后玉米叶片;2, 接种黑粉菌10 d后玉米叶片;3, 黑粉菌冬孢子。M, DNA marker;1, Maize leaves 3days after inoculation of U.maydis;2, Maize leaves 10 days after inoculation of U.maydis;3, Teliospores of U.maydis.

M, DNA分子质量标记;1, 接种黑粉菌10 d后玉米叶片;2, 黑粉菌冬孢子;3, 未接种玉米叶片。M, DNA marker;1, Maize leaves 10 days after inoculation of U.maydis;2, Teliospores of U.maydis;3, Uninoculated maize leaves.

2.5 实时荧光定量PCR灵敏性测定

对50ng/μL的黑粉菌DNA进行倍比稀释, 以稀释后的DNA为模版进行实时荧光定量PCR扩增。扩增结果如表1, 实时荧光定量PCR扩增的最大Ct值为34.19。根据2.4的公式可推算出对应拷贝数为19, 即最低检测限为19拷贝/反应。将实时荧光定量PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测, 结果表明, 以19拷贝为模板的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上仅能显示微弱条带 (图略) 。

2.6 实时荧光定量PCR检测玉米叶片中的玉米黑粉菌

对接种黑粉菌后1、3、7、10和20d的玉米叶片总DNA进行实时荧光定量PCR检测, 所得结果如下 (表2) 。该结果表明, 利用实时荧光定量PCR可以对接种后1d的玉米叶片菌含量进行精确定量检测, 并且实验重复性好。同时检测结果也表明, 玉米黑粉菌在接种7d之后, 病菌量才出现大幅度增加。

3 讨论

田间菌量累积是玉米黑粉病发病严重的重要原因。一些地区玉米多年重茬连作, 玉米收获后病株秸秆直接还田, 造成病菌随病株留在田间;土壤耕作多采用悬耕, 造成病残体腐烂慢, 加之病菌冬孢子对不良环境有极强的耐受力[12], 致使病菌在土壤中逐年积累。条件适宜时冬孢子萌发, 造成玉米黑粉病的严重发生。所以, 对玉米种植田块进行玉米黑粉菌量的监测有助于玉米黑粉病的预测、预报及防控。

显微镜观测一直是检测、鉴定病原微生物的有效方法, 但是该方法灵敏度相对较低。由于杂菌的影响, 常常需要对病菌进行纯培养, 所以利用显微镜检测病原菌常常费工费时。自从PCR技术产生以后, 该技术迅速成为检测病原微生物的有效途径, 在多个领域都有广泛的应用[1,2,3,4]。在玉米黑粉病原物检测方面, 研究相对较少。最早利用斑点杂交和PCR扩增的方法对玉米黑粉检测研究表明, PCR检测的方法灵敏度明显高于斑点杂交, 利用PCR对玉米黑粉检测的最低DNA量为8pg[13]。墨西哥的研究小组利用黑粉菌有性发育调节基因b E作为目标基因检测黑粉病菌的研究表明, 可以在接种后4d的玉米叶片总DNA中检测出玉米黑粉菌[14]。而本实验构建的实时荧光定量PCR体系对玉米黑粉菌的最低检出率为19拷贝/反应, 可以准确检测经注射接种后1d的玉米叶片中的黑粉菌量, 所以该实验体系比以往的检测玉米黑粉菌方法的灵敏度有了显著提高。

近些年, 关于对病原物检测的研究越来越多[15,16,17], 除了使用常规SYBR GreenⅠ染料法之外, 许多研究利用了Taqman探针检测的方法。研究表明, Taqman探针法较染料法的特异性和灵敏性都有所提高[18]。另外, 一种能对病原物精确定量的新型检测方法──数字PCR也已经出现[19,20]。数字PCR在准确定量低丰度表达基因方面有着传统实时荧光定量PCR不可比拟的优越性。将来, 有望借助以上研究手段进一步提高玉米黑粉病菌检测的灵敏度和准确度。

4 结论

本研究利用实时荧光定量PCR的方法, 以βactin为内参基因, 通过构建系列浓度的质粒标准品, 建立了对玉米黑粉菌进行定量分析的方法。该方法特异性强、重复性好、用时短且安全无污染, 能准确检测含玉米黑粉菌高于19拷贝/反应浓度的样品。该方法可广泛用于定量检测玉米黑粉菌量, 可为该病情的预测预报提供依据。

摘要：目的:建立利用实时荧光定量PCR对玉米黑粉菌[Ustilago maydis (DC.) Corda]快速定量检测的方法。方法:以玉米黑粉菌βactin基因为内参基因, 以含有βactin基因的具浓度梯度pMD19 T-Simple质粒为标准品, 接种黑粉菌后不同时间点的玉米叶片作为样本用以检验该方法的实用性。结果:建立了利用实时荧光定量PCR对玉米黑粉菌进行定量分析的方法。该方法重复性好、特异性强、灵敏性高, 对玉米黑粉菌的最低检出率为19拷贝/反应, 可以准确检测经注射接种后1 d的玉米叶片中的黑粉菌量。结论:建立的实时荧光定量PCR方法可用于玉米黑粉菌菌量的检测。

5.实时荧光定量PCR研究进展及其在中药领域的实践的论文 篇五

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取来该院就诊的322例乙型肝炎患者为研究对象。其中男性158例, 女性164例, 平均年龄38.2岁。实验分为4组, 分别为大三阳组 (50例) ;小三阳组 (119例) ; (1) (5) 阳性组 (56例) ; (2) (4) (5) 阳性组 (97例) 。

1.2 试剂与仪器

仪器为ABI7500Fast荧光定量分析仪。

1.3 方法

HBVDNA用FQ-PCR检测;HBV血清标志物用ELISA检测, 按照试剂盒说明操作。

德国罗氏公司荧光量PCR仪为德国赛博公司产品。FQ-PCR方法检测HBV-DNA试剂盒由广州安基因科技有限公司提供, ELISA法试剂购自北京万泰生物药业股份有限公司, 检测仪器为BIO-RADMODEL550型酶标仪。

采集空腹静脉血, 分离出血清, 采用ELISA方法检测HBg Ag、HBs Ab、HBe Ag、HBe A、HBc Ab, 用FQ-PCR法检测HBV-DNA, 用已知含量梯度的HBV-DNA标准品为参考照物, 对比得出本DNA含量, 并设置阴性对照, 采用室内Roche免疫质控血清进行检测。操作方法和结果判定均严格按说明书执行。HBV-DNA>5×103copies/ml为阳性, <5×103copies/ml为阴性。

1.4 统计方法

数据用SPSS19.0统计学软件对数据进行处理。计数资料采用χ2检验。

2 结果

不同血清模式组中乙肝病毒标志物阳性率。

322例标本中, 第 (1) 组 (大三阳组) , HBV-DNA阳性率及HBV-DNA含量显著高于其他组, 差异有统计学意义 (χ2=29.835, P<0.01) ;第 (2) 组、第 (3) 组之间差异不大, 但和第 (4) 组比较差异有统计学意义 (χ2=60.393, P<0.01) , 见表1、2。

不同血清模式组中HBV-DNA含量显示, 不同组别的HBV-DNA含量有较大差异。第 (1) 组HBV-DNA平均含量为3.86×10IU/m L, 和后三组比较, 差异有统计学意义。

在50例HBe Ag阳性患者中, HBV-DNA阳性率为100%, 明显高于与HBe Ag阴性组, 两者差异有统计学意义 (χ2=75.983, P<0.01) 。见表3。

3 讨论

ELISA法检测乙肝病毒标志物是传统的灵敏度高、特异性较好的方法[1], 但它只能反映乙肝病毒入侵后机体的免疫状态, 而FQ-PCR则是从基因水平定量反映乙肝病毒是否感染、复制的一种更灵敏的检测方法, 目前已广泛的应用于临床。

本研究显示不同的乙型肝炎血清标志物表达模式, HBV-DNA的含量相差甚大。在大三阳组中HBV-DNA阳性率为100%, 含量超过平均含量为3.86×107IU/m L, 显著高于其它组, 表明大三阳患者体内乙肝病毒复制活跃, 传染性强。HBe Ag位于乙肝病毒的核心, 是HBV基因组前C/C区段的m RNA表达, 通常被认为是病毒复制活跃、传染性强的标志[2]。该研究结果表明, 50例HBe Ag阳性患者中, HBV-DNA阳性率为100%, 二者具有明显的伴随关系, 呈正相关性;而在174例HBe Ag阴性的患者中, 也并非没有HBV-DNA的复制, 推测可能与HBV基因组发生突变有关。基因突变时, HBe Ag表达会减弱甚至消失, 因此即使抗-HBe出现, 病毒复制并没有停止, 一部分人群仍具有传染性, 并且此类人群以肝硬化者居多[3], 需要引起重视。本研究中, 在HBs Ab阳性的患者中, 检出7例HBV-DNA阳性, 说明即使抗-HBs及抗-HBe出现, 病毒依然具有低水平的复制能力, 这可能是机体正处于隐形感染的恢复期或病毒已发生变异[4], 因此, HBV血清标志物不能取代HBV-DNA定量检测。

综上所述, 在乙型肝炎的诊断和治疗方面, 单纯检测HBV血清标志物是不全面的, 应结合HBV-DNA定量来对病情进行判断和治疗[5]。HBe Ag转阴并不意味这HBV病毒已被清除[6]。因此, 要准确了解乙型肝炎患者体内的病毒复制情况, 采用FQ-PCR和HBV血清学标志物检测相结合的方法, 才能在乙型肝炎的诊断、病情判断、治疗方案的选择方面提供更加可靠的依据。

摘要：目的 探讨乙型肝炎病毒感染者血清HBV DNA定量与血清乙肝病毒标志物的关系。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应 (FQ-PCR) 检测血清HBV-DNA含量, 酶联免疫法检测血清乙肝病毒标志物。结果 大三阳组HBV-DNA阳性率及含量显著高于其他组, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;HBeAg阳性患者中, HBV-DNA阳性率为100%, 与HBeAg阴性组比较, 两者差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论 要准确了解乙型肝炎患者体内的病毒复制情况, 采用FQ-PCR和HBV血清学标志物检测相结合的方法, 才能在乙型肝炎的诊断、病情判断、治疗方案的选择及预后方面提供可靠的依据。

关键词：HBV-DNA,FQ-PCR,乙型肝炎血清标志物

参考文献

[1]实时荧光PCR检测乙型肝炎患者HBV-DNA的临床意义[J].临床和实验医学杂志, 2012, 11 (18) :1483-1485.

[2]Jaroszewicz J, Serrano BC, Wursthorn K, et a1.Hepatitis B surface antigen (HBsAg) levels in the natural history of hepatitis Bvirus (HBV) 一infection:A European perspective[J]Journal of Hepatology, 2010, 52 (4) :514-522.

[3]黄松洁, 林永志.HbeAg定量与HBV-DNA定量的相关性及临床意义[J].检验医学与临床, 2010.7 (12) :1236-1239.

[4]邹敏.实时荧光PCR检测在乙型肝炎病毒DNA检测方面的临床意义[J].中国医药指南, 2010, 8 (19) :196-197.

[5]乙型肝炎血清标志物定量检测与HBV-DNA定量检测的相关性及临床意义[J].西部医学, 2012, 24 (5) :987-991.