细胞培养注意事项--自我总结重要

细胞培养注意事项--自我总结重要（共5篇）

1.细胞培养注意事项--自我总结重要 篇一

动物细胞培养总结 一．实验准备

1.实验器械、器皿的清洗和消毒（1）清洗和包装

离心管(1.5ml，2ml,15ml)若干，冻存管若干放进铝饭盒，用牛皮纸包裹，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。

蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。取适量蒸馏水于4L玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。

过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂刷洗，蒸馏水润洗，烘干。

过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。

玻璃瓶拧下瓶盖，瓶身浸酸。浸酸时应注意安全，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁以便浸酸结束后清洗耐酸手套，防止走动时酸液滴到地板上不好清洗。瓶口慢慢沉入液面下，注意缓慢降低瓶身，使液体慢慢浸入瓶内，以免产生气泡溅出酸液，发生危险。浸酸时器皿要充满酸液，勿留气泡，浸泡过夜。取出瓶身时，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁，取出后将瓶身放入盆内水中在转移至水池边清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。换水洗几次，待水澄清后开始冲洗，每瓶都用自来水灌满，倒掉，重复15次，再用蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。（2）消毒灭菌

1>全自动高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，放入物品，瓶类物体须拧松盖子后放最上面一筐，盖上灭菌锅盖，拧紧盖子至温度显示栏的左上角有一红点亮灯，按start开始升温。若灭有无菌水或玻璃瓶待降温至常温再打开，打开后立即拧紧，无菌水瓶口封上封口膜。若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可打开灭菌锅，须戴上线手套取出。

2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。加温升压之前，先打开排气阀门，加温约半小时后见排气阀处开始排残留在锅内的冷空气，排气五分钟，关闭排气阀，继而开始升压。灭菌后不要立即打开气阀放气以免水汽喷出。待自然降温至常压才能打开气阀。

玻璃瓶须拧紧，饭盒，枪头灭菌后放入烘箱烘干备用。2.无菌间消毒及设备检查

用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兑水，抹布、拖把擦洗。配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔细擦拭CO2培养箱，超净台，超净台内物品，显微镜，桌面，若培养箱内未培养细胞可以再打开高温灭菌模式将培养箱灭菌一次。

用蒸馏水擦拭清洗水浴锅内壁，注意底座不要沾水。检查CO2总压力表，若读数不足四分之一提前预定CO2瓶，换瓶时需要扳手。CO2培养箱最下层的增湿盘须定期观察加水，将增湿盘内注入1/2无菌蒸馏水，并将盘直接放置在培养箱中央。启动培养箱，培养箱接通电源，增湿盘加水，连接好气体供给，检查有无漏气，输入系统设置。设置温度和二氧化碳。

紫外照射无菌间30分钟，注意屋内不要有人以及培养基等试剂。3.细胞培养用液的配置及分装

RPM1640培养基配制：将干粉型RPM1640培养基溶于总量1/3的去离子水中，再用1/3水冲洗包装内2次，倒入培养基中，以保证所有干粉都溶解成培养液，根据产品说明的要求和实验补加谷氨酰胺和NaHCO3 ,倾斜三角瓶轻轻放入转子，用磁力搅拌器搅拌2h。用泵使培养基在超净台内通过灭菌的过滤器，过滤除菌，分装后置4度冰箱保存备用。使用前调pH至7.0，加双抗于培养液中浓度为1%，使用时加胎牛血清10%FBS.胎牛血清FBS的处理：使用前应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体，将胎牛血清放入56度水浴中30分钟，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。分装前提前2天放4度冰箱解冻，溶解完全后于超净台内分装为25ml每管，留2管放四度备用，余下放-20度冻存。配制含血清培养基或冻存液前务必提前一天取出分装后的血清四度溶解备用，血清融化很慢。

5%NaHCO3溶液配制：5g NaHCO3，100ml蒸馏水，NaHCO3溶于水后，过滤除菌。0.25%胰蛋白酶液200ml在超净台内分装成每管1ml或2ml，封口膜封口，-20度备用。

双抗溶液配制：80万单位青霉素加4ml灭菌D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。100万单位链霉素加5ml灭菌的D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。两溶液各取0.5ml混合，加入9mlD-Hanks液，则成含青链霉素各1万单位/ml，分装后置于4度冰箱保存备用。

二．操作步骤 注意事项：

1、所有实验用的器械，仪器灭菌，消毒，烘干。

2、打开溶剂，培养瓶瓶盖时，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。

3、用完溶剂，培养瓶时，瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。

4、所有物品放入超净台需用酒精棉擦拭，包括手伸出窗口拿取物品再回到窗内时需要重新用酒精棉擦拭。开始工作：

1、实验前换紫外照过的白大褂和拖鞋。

2、戴橡胶手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。

3、取待用的细胞，旋紧瓶盖。

4、胰酶消化缓慢时可以将细胞置于5%CO2、37度培养箱中1min-2min，目的是提高酶活性，促进消化。1.细胞复苏

提前预冷离心机，设参数为4度，1000r/min,5min。

将枪头，装有离心管的饭盒，垃圾盒放入超净台，酒精棉擦一遍超净台台面和移液器尤其枪口，以防别人用枪时不慎沾染脏污堵塞枪口。超净台和房间照15分钟紫外，照紫外的同时取出无血清培养基和含血清培养基37度水浴加热。

关闭紫外，打开风机，升高窗高，点燃酒精灯，用镊子从饭盒中取2个15ml离心管放至试管架，每管加入3ml无血清培养基，提前剪好2条封离心管的封口膜备用。

戴上橡胶手套再套上线手套，用镊子从液氮中取出塑料冻存管，用手拿冻存管迅速浸入37度水浴中，剧烈急速摇晃冻存管，因为有防水胶布缠裹不用担心进水染菌，使其急速融化，注意管内冻存细胞的融化情况。基本转为液态时将冻存管取出，摘下线手套，冻存管转移至超净台内，用酒精擦手，擦拭冻存管尤其管口，撕下胶布和封口膜，再擦拭管口，整个溶解过程尽量在30s至1min内完成。(注意：这一步对细胞存活率至关重要。既要尽快融化以减少融化过程对细胞的损害，又要尽可能减少细胞在较高温度停留的时间以减少DMSO对细胞的毒害，切不可将冻存管放在烧杯内不管。)打开冻存管管盖，逐滴加入1ml无血清培养基，轻柔地将冻存管内的细胞悬液吸取出来，转移至已备好的离心管内，轻轻摇混匀，盖上管盖，轻轻地上下颠倒混匀。封上封口膜。

低俗离心1000r/min,5min。小心地吸出上清液，要求上清液尽可能吸走，同时又不触及管底沉淀的细胞。（较高要求时可以用手指轻弹离心管管底，将细胞团分散，加入10ml无血清培养基混匀离心10min弃上清再洗一次，有助于减少DMSO残留。）加3至5ml培养液至沉淀的细胞，轻轻摇晃使分散成细胞悬液，将细胞转移至培养瓶中，拧紧盖子，转移至培养箱中再反旋拧松半圈，以利于瓶口内外进行气体交换，注意取出培养瓶时须先拧紧瓶口。37度恒温箱中培养。第二天观察细胞生长情况。培养基瓶盖过火，拧紧后封上封口膜。收好物品，擦一遍台子，灭酒精灯。2传代培养

附着型胞(adherentcell)传代培养

离心法提前预冷离心机，设置好参数4度，1000r/min,5min。倒液法不需要。

将灭菌枪头，装有离心管的饭盒，新培养皿/瓶,垃圾盒放入超净台，酒精棉擦一遍超净台台面和移液器尤其枪口，以防别人用枪时不慎沾染脏污堵塞枪口。超净台和房间照15分钟紫外，照紫外的同时从冰箱取出PBS,胰酶，含血清培养基于37度水浴加热。关闭紫外，打开风机和照明，升高窗高，点燃酒精灯，将所需试剂先擦瓶底，放在台子上再擦侧壁一圈，擦瓶口瓶盖，撕下封口膜，再仔细擦一遍瓶口。用喷过酒精的塑料筐将细胞培养瓶拧紧盖子拿到超净台旁的椅子上放平放稳，每三瓶/皿一摞拿入超净台先擦最下面一个的底部，擦好后放在台面上，擦一摞的侧面一圈，在分别擦底面顶面瓶口，直到所有培养瓶各个面及瓶口擦好，注意不要擦到有marker标记字迹的部位，酒精会擦掉字迹，若擦到字迹待酒精干后立即补写上以防事后记不清。

轻轻倒掉旧培养液，注意不要使液体倒流回来冲击细胞，挂在外壁的残留液滴用酒精棉擦掉,培养瓶可以轻轻翻转瓶子使细胞生长的面在上，顶面在下，液体留至顶面后直接倒掉液体。加1ml PBS，注意枪冲着不长细胞的培养皿侧壁或翻转培养瓶朝瓶的顶壁或侧壁打入PBS，尽量不碰到瓶口或培养皿，若怀疑碰壁，弃掉枪头。轻轻摇晃培养皿或瓶，使PBS沾到所有细胞，洗涤细胞一遍，轻轻倒掉PBS。

加入0.25%胰蛋白酶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，若是高倍胰酶先稀释（0.25%为1X胰酶），37℃作用数分钟。等待消化期间准备好新的培养皿/瓶，每25cm2小皿/瓶加入2ml含血清培养基。消化中的皿盖好盖子或瓶拧紧盖子，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状，有10%细胞漂动时，倒掉胰酶溶液，加入1ml(25cm2小皿/瓶)含血清之新鲜培养基终止胰酶作用。(若细胞将要分离而呈现圆粒状且80%细胞漂动，则不移去胰酶，在胰酶作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止胰酶作用，吹打成细胞悬液转移至离心管，封上封口膜，离心后再吸掉上清液。）

轻轻摇晃培养瓶使细胞自瓶壁脱落，以吸管上下轻轻吸放数次以打散细胞团块，注意吹打时有系统性的将所有面积都打到不要集中只吹打一处而一些地方没吹打到，吸和吹时枪头都不要离开液面以减少气泡，气泡多破裂时对细胞有冲击且会增加体积不利于操作，培养瓶吹打时操作角度小不方便，用倒液法（10%细胞漂动即倒掉胰酶加含血清培养基终止消化）时吹打细胞要用二档多吹打几次，用皿或离心法（80%细胞飘动不弃胰酶直接加含血清培养基再离心弃上清）时细胞很容易脱落，可以用一档轻轻吹打，保证所有面积都吹打到即可。混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，拧紧瓶盖，镜下观察细胞数量多，培养液澄清，若细胞密度过低将影响生长可适当补充细胞悬液，若细胞密度过大将影响迅速生长一天后即需传代，可根据实验适当添加培养基或细胞悬液使生长速度符合预期，转移至CO2培养箱，拧松半圈瓶盖，37度培养。试剂瓶瓶盖过火，拧紧后封上封口膜。密封收好物品。擦一遍台子，灭酒精灯。

3细胞换液

取待用的细胞，旋紧瓶盖。

弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。

用微量枪加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。

用微量枪加入适量的细胞培养液于培养瓶中。旋紧瓶盖。将细胞置于5%CO2、37度培养箱，反旋拧松瓶盖半圈，培养。

4细胞冻存 1>准备工作：

提前一天将血清FBS从-20度取出放在4度冰箱解冻。选取对生增生期细胞（镜下密密麻麻，胞体突触明显），在收集细胞24h前换液一次。

进入细胞室前，首先用75%酒精擦试工作台，接着紫外灭菌30，过后，关闭紫外灯，通风10min。从冰箱中取出胰酶、PBS缓冲液、培养基，血清37度水浴。取出室温放置的DMSO。找到防水的医用胶布，滤菌膜，针管和所需枪头饭盒等物品，喷一遍酒精，放入台子照紫外。2>开始工作：

实验前在更衣间换上紫外照过的白大褂和拖鞋。戴上橡胶手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。酒精擦拭胰酶、PBS缓冲液、培养基放入超净台。过火镊子取出离心管于试管架，剪好封口膜备用。用滤菌膜和针管过滤DMSO以除菌。

75%无血清培养基，20%的血清，5%过滤除菌的DMSO，混匀配制成所需的冻存液。

取待用的细胞，旋紧瓶盖。

弃去旧的培养液，挂壁残液注意用酒精棉擦去，用微量枪朝不长细胞的侧壁或顶部打枪，加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。用微量枪朝不长细胞的侧壁或顶部打枪，加入适量胰酶约2ml，弃掉枪头。消化数分钟，等待期间，用过火镊子从饭盒中取出冻存管和管盖标记好细胞名称和冻存日期，直立于台面备用。

用微量枪加入适量的完全培养液冲洗（吹散细胞）细胞，将瓶底粘着的细胞吹散下来，再将细胞悬液移入的离心管中，封口，标签。离心5min，1000转/min。

细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液。用微量枪将冻存液平均加入离心管中，混匀离心管中细胞冻存液。用微量枪将含细胞的冻存液移入冻存管中，封口膜封口，防水医用胶布再缠一圈，标签时间，细胞名称。

冻存，需缓慢冻存，先放置4度冰箱20min，然后放置-20度冰箱30min，再置于-80度冰箱过夜，最后置于液氮灌-196度中保存。5 铺板和细胞计数

用传代方法制成细胞悬液。倒掉培养基，用PBS液洗涤后，0.25%的胰蛋白酶液消化，加入培养液吹打制成待测细胞悬液转至离心管，封上封口膜，离心1000r/min,5min。

等待离心其间，取细胞计数板，盖玻片酒精擦拭，均在酒精灯上烤一下，将盖玻片盖在细胞计数槽上，使覆盖细胞计数板上的上下两个“十字”区域。取一只新的15ml离心管，做好标记，摆放好。离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液，加入全培养液吹散沉淀细胞成细胞悬液，拧紧管盖，上下颠倒混匀。用枪吹打混匀离心管中含完全培养液的细胞，再从离心管中取1ml细胞悬液移入新的15ml离心管，加入4ml完全培养液，即稀释五倍，吹打混匀细胞悬液，上下颠倒混匀细胞悬液。

上下颠倒混匀新15ml离心管内细胞悬液，计数前将待测液吹打均匀，用微量枪从新15ml离心管中取出细胞悬液（约10μl），滴入计数板上盖玻片的一侧缝隙旁，虹吸作用液体会吸入盖玻片下（不能有气泡，不然会影响细胞计数，注意滴入悬液量不能太大致使细胞悬液流入旁边的槽中），镜下观察细胞，数出计数板四角大方格中的细胞数（16个小格×4个大格），用计数器计数（约200个）

细胞数 万个/mL原液=（4大方格细胞数之和/4）×稀释倍数（常稀释5倍，若细胞过多不能数清则加大稀释倍数，不断调整新离心管中细胞悬液的细胞浓度，直至镜下观察细胞数目符合要求。）每皿/瓶需铺板50-100万个细胞，根据细胞计数算出每皿所细胞悬液需毫升数，加入悬液时注意混匀，不得有气泡，吸时注意每次枪尖是否都吸满液体。每皿加入细胞悬液后，用含血清培养基补足至2ml/皿/瓶。24h后观察细胞长至八成满时即可加药处理。

6检验判断细胞状态与加药处理

细胞复苏或传代后24内不可传代，传代4小时后开始贴壁。1>培养基颜色澄清度：

正常生长的细胞培养基澄清透明，倾斜使培养基聚集，对着灯看可透光，若出现丝状沉淀或倾斜培养基对着灯看出现浑浊不透光且镜下细胞之外的部分有密密麻麻的小黑点，很可能是染菌，应弃掉。若镜检在细胞之外部分有一些浑浊，可能因为细胞代谢旺盛分泌物堆积，或者因为消化时间不够以至于过度强硬吹打细胞，造成细胞损伤产生大量细胞碎片，应换液。

新鲜培养基呈粉红色，代谢代谢旺盛的细胞的培养基会变黄，此时若细胞贴壁应换液，若此时细胞已长满，应传代。2>密度：

细胞密度过低，镜下观察稀稀疏疏，则生长缓慢，甚至死亡。较大的细胞密度可促进细胞之间相互作用，促进细胞增殖生长。密度过大，密密麻麻，部分细胞不能伸展成圆形，必须传代，此时不传代，一两天后细胞状态持续不好，开始死亡，镜检漂浮细胞增多。3>状态：

镜下观察细胞，当左右上下移动镜头时漂动的是未贴壁细胞或死细胞，固定不动的是贴壁细胞，贴壁细胞是活细胞。

状态良好的贴壁SY5Y细胞有圆形的胞体和细细分支的突触，突触分明。状态不好的SY5Y细胞，突触不明显，看不到什么细细的分支，甚至成圆形。

消化时快离壁的细胞呈亮亮的圆形。

加药前应提前计算好药品浓度体积，根据实验处理要求的浓度换算出每皿应加药品稀释液体积和无血清培养基体积，列成表格以备加药时明确操作。将药品储备液稀释成稀释液，再与相应体积的无血清培养基在离心管中混合好。加COS时，倒掉含血清培养基，PBS荡洗一遍，加以混合好的药品。加COS 3小时后加Ab，Ab须提前37度水浴5小时，加药时采用半数放液法，弃去1ml原培养基，加入1ml已混合好的药品。

2.细胞培养注意事项--自我总结重要 篇二

1 材料与方法

1.1 一般材料

4~6周龄(120~150 g,SPF级,屏障环境中饲养,普通饮食)健康雄性Sprague-Dawley大鼠由北京大学第一医院实验动物中心提供,许可证号:SYXK(京)2016-0001;DMEM/F12培养基、I型胶原酶和木瓜蛋白酶购自Gibco公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自Hyclone公司;免疫组化用小鼠抗大鼠α-SMA和Vimentin单克隆抗体购自武汉博士德公司,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)和异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的二抗购自碧云天公司,胰酶细胞消化液购自北京普利莱公司;超净工作台为Thermo公司产品(Heraguard ECO 1.5)、倒置相差显微镜为日本Olympus公司出品(BIO500-PH)、CO2培养箱为日本SANYO公司产品(MCO-18AC)、荧光显微镜为Leica公司产品(AF6000)。

1.2 大鼠AFs的原代培养

1.2.1 大鼠血管外膜的获取

取雄性Sprague-Dawley大鼠,麻醉后断颈处死,立刻浸泡于75%酒精中,5 min后转移至无菌手术台上,沿正中线剪开大鼠胸腔和腹腔,可见胸腹主动脉沿脊柱左侧缘走形,剪取胸腹主动脉,浸泡于Hanks缓冲液中,无菌条件下转移至超净工作台。先用含青链霉素的灭菌磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)冲洗血管内外残留的血液,钝性分离血管周围的结缔组织,然后用眼科剪将血管纵向剖开,使内膜面向上,用眼科弯镊自上而下轻轻刮除内膜后,再小心撕下近内膜面的中膜平滑肌层,剩余的絮状乳白色组织即为血管外膜[3,12,13]。

1.2.2 贴块法获得Afs

将血管外膜组织用眼科剪剪成大小约1 mm×1 mm×1 mm的组织块,均匀平铺在25 cm2培养瓶的底部。轻轻翻转培养瓶使瓶底面向上,向培养瓶中加入约6 m L含20%FBS的DMEM/F12培养基,务必不要将组织块冲掉。将培养瓶置入37℃、含5%CO2细胞培养箱中直立静置2~4 h后,慢慢翻转培养瓶,使培养液缓慢覆盖组织块,继续培养约72 h后,可见AFs自组织块周围爬出。此时,不常规换液,仅向培养瓶中补加3 m L含20%FBS的DMEM/F12培养基,既保证细胞生长所需的营养成分,又不会对培养液的PH值、温度等造成大的影响。4~6 d后,待细胞生长达到70%~80%融合状态时即可按1∶4传代,取2~3代细胞进一步实验[14]。

1.2.3 消化法获得Afs

取血管外膜组织,剪成小块后,加入1 m L消化液(消化液配方[15,16]:I型胶原酶0.5%、木瓜蛋白酶0.05%、牛血清白蛋白0.2%、二硫苏糖醇1 mmol/L,使用不含氯化钙的Hanks平衡盐溶液溶解),37℃水浴15~30 min,然后经200目不锈钢滤网过滤消化液,加入2 m L培养液终止消化,1000 r/min离心2 min,弃掉上清液,加入5 m L含20%FBS的DMEM/F12培养基重悬,将细胞接种于60 mm的培养皿中,置于37℃、含5%CO2细胞培养箱中培养,24 h后换液。此后每隔48 h换液一次,直至消化传代。

1.3 AFs的鉴定

盖玻片泡酸并高压消毒灭菌后,置于培养皿中,将AFs悬液种植于培养皿,待细胞生长至50%融合状态时,倒掉培养液,PBS冲洗,4%多聚甲醛固定20 min,用含0.3%Triton X-100、1%牛血清白蛋白的PBS透化处理,加封闭血清室温封闭60 min后,倒掉封闭血清,加小鼠抗大鼠α-SMA抗体及Vimentin抗体,37℃孵育2 h,PBS冲洗3 min×3次。免疫荧光法:滴加FITC标记的山羊抗小鼠二抗,避光孵育60 min,倒置荧光显微镜下观察结果,拍片。二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色法:滴加HRP标记的山羊抗小鼠二抗,室温孵育60 min后,PBS冲洗3 min×3次,滴加DAB显色液,在显微镜下观察控制反应速速,1~5 min即可,自来水充分冲洗,苏木素复染,盐酸酒精溶液浸泡返蓝,中性树胶封片,显微镜下观察结果,拍片。

1.4 细胞生长曲线测定

分别将贴块法和消化法两种培养方法获得的第2代AFs消化,细胞计数后,用含10%FBS的DMEM/F12培养基调整细胞浓度为2×104个/m L,每孔1 m L接种于12孔培养板,放置培养箱内培养,每隔24 h收集每组3孔细胞并计数,取平均值,连续计数7 d后绘制生长曲线[17]。

1.5 统计学方法

采用Graph Pad Prism 5.0软件进行数据分析,计量资料采用均数±标准差(±s)表示,两组之间均数的比较采用t检验,多组间比较用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AFs的原代培养

血管外膜组织块在培养72 h后,可见少量成纤维细胞自组织块边缘爬出,渐向外生长形成细胞晕,进而形成细胞簇(图1a)。刚长出的细胞呈圆形,后变为椭圆形,随后细胞逐渐展开,伸出伪足,形态多样,呈梭形、多角形、星形或不规则形,大小略有差异(图1b)。细胞逐渐围绕组织块呈放射性生长,聚集成片(图1c),传代后80%~90%的细胞可重新贴壁生长,其生长方式及形态特点同前一致。消化法得到的细胞散在、成片分布,细胞形态和贴块法一致(图1d)。

2.2 AFs的鉴定

取第2代AFs进行鉴定,待细胞长至50%融合状态时,固定细胞,加入α-SMA及Vimentin一抗抗体孵育后,再滴加FITC/HRP标记的二抗,显微镜下观察、拍片。可见α-SMA在细胞中基本没有表达(图2a、2c),而Vimentin在AFs中高表达(图2b、2d),证实培养的细胞为典型的AFs。

2.3 两种方法获得的细胞生长曲线比较

传代后AFs悬浮于培养液中,在重力的作用下逐渐下沉至培养板底,散在分布于培养板中,初始形态为圆形,后逐渐变成纺锤形、梭型、不规则性,细胞逐渐增大,3~6 h即完全贴壁,细胞伸出伪足并相互交织成网,逐渐形成细胞单层,铺满瓶底。AFs的倍增时间较短,在一段时间内AFs数量与时间呈正相关,1~3 d为细胞增殖期、3~6 d为对数生长期、6~7 d为平台期,与人皮肤成纤维细胞类似[17]。本项目中贴块法和消化法所得细胞在细胞增殖期、对数生长期和平台期的时间大致相同,二者的生长、增殖比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

贴块法是将组织剪成小块,贴附在培养瓶上,加入培养液浸没组织块,让细胞从组织块中爬出的一种方法,其优点在于操作简单、步骤少、成本低、影响因素少、细胞爬出时间固定,便于实验者把控时间[3];缺点在于部分组织细胞爬出慢、耗时长。消化法常采用胶原酶、胰酶、弹力酶、透明质酸酶及链霉蛋白酶等酶将组织消化分散,使细胞从组织中脱落出来。优点在于培养时间短,短期内可以获得大量细胞;缺点在于操作复杂、不同组织消化时间长短不固定、不同种类的消化酶对细胞状态影响较大、步骤繁琐带来污染概率增加,且消化酶昂贵,因而消化法的应用受到一定限制。本项目参考北京大学第一医院风湿免疫科博士生高兰、樊勇等人的经验[15,16],采用组合酶消化法,消化时间控制在0.5 h以内,可以短时间内获得大量活细胞。一般而言,贴块法从获取组织到细胞传代需要7~10 d,而消化法只需要5~6 d。细胞在传代以后,两种方法获得AFs在增殖期、对数生长期和平台期的时间大致相同,因而两种培养方法在这一阶段相比没有差异。

AFs原代培养时难免混杂少量的其他细胞,包括平滑肌细胞、内皮细胞、脂肪细胞等,利用AFs生长速度快、数优的特点,在传代培养过程中能排斥其他细胞而优先增殖,经过几代的传代生长后,能达到自然纯化的效果,得到较高纯度的AFs[18]。Vimentin是细胞骨架中间纤维家族成员,主要在成纤维细胞中表达;α-SMA主要表达于平滑肌细胞,所以可根据Vimentin表达阳性/a-SMA表达阴性来鉴定成纤维细胞。本项目中两种方法培养的细胞,使用免疫组化方法鉴定,可见Vimentin表达阳性/a-SMA表达阴性,故而可以确定所培养的细胞为AFs。

原代培养第一次传代时机的掌握非常重要,一般认为选取细胞接近或完全融合成片时进行传代。贴块法原代培养时由于组织块的分布不均匀,且活性不一,导致细胞生长也不均匀,经常是一些区域已长成致密细胞层,一些区域仍未见细胞爬出,这种情况下,当整瓶细胞达亚融合时,致密细胞层已“老化”,功能状态不佳。所以可根据细胞生长状况在细胞未达80%融合时进行“原瓶”传代,使细胞能均匀贴壁生长及避免局部细胞“老化”。在细胞传代消化以细胞成片收缩、变圆变亮、细胞间隙增大时为宜,若消化过度、时间过长,易严重损伤细胞膜,细胞难以贴壁成活,影响后续实验,经验是胰酶定量、时间固定、操作迅速、动作轻柔、及时终止消化。

综上所述,组织贴块法和消化法均能成功培养AFs,两种方法获得的细胞性状稳定、存活率高,为从细胞水平研究血管重构性疾病的发病机制提供了可靠的模型。

摘要：目的 比较两种血管外膜成纤维细胞(AFs)培养方法的差异并总结经验。方法 获取大鼠主动脉血管外膜组织,切成小块,一部分采用组织贴块法进行原代培养,另一部分使用消化酶消化获取细胞,使用相差显微镜观察细胞形态、免疫组化鉴定细胞内特定蛋白表达、细胞计数计算生长曲线等实验手段,并比较两种方法之间的差异。结果 贴块法和消化法均能成功获得AFs;经免疫组化检测,两种方法所获的细胞波形蛋白(Vimentin)表达阳性/a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)表达阴性,证实培养的细胞为AFs。两种方法获得的细胞在细胞增殖期、对数生长期和平台期的时间大致相同,二者的生长、增殖比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 贴块法和消化法均能成功培养AFs,所获得的细胞性状稳定、存活率高,可在体外稳定地传代培养,在血管重构研究领域具有应用价值。

3.浅谈培养学生自我管理的重要性 篇三

【关键词】 自我管理 管理模式 强化培养

传统的班级管理，主要以教条式的制度来制约学生，班主任是管理的核心，对学生进行"超级保姆式"的全方位监护，学生的天性是活泼好动的、调皮、捣蛋的背后可能蕴藏着智慧和创造力，可是在班主任的监管下，学生对教师俯首贴耳，循规蹈矩，他们的天性被扼杀。著名教育家苏霍姆林斯基说："只有能够激发学生去进行自我教育的教育，才是真正的教育"在班级工作中，应坚持"说服为主，灌输为辅"的原则，变"一言堂"的说教为"群言堂"的辨析，让学生自悟。此外根据学生心理特点，建立一种自我管理的模式，采用多种方法来管理学生，在管理中，班干发挥引导作用。我深深感到教育工作不能简单粗暴要因势利导，同时还要给学生自我管理和自我教育的自由空间，这样才能引导学生改正缺点，良好的班风在这之中得到巩固。总之，在班级建设中，要充分发挥每个同学的潜能，调动学生参与的主体性，形成教育的合力，使集体的成员紧紧凝聚在一起，这样才能形成良好的班风。在班集体的建设中，我尝试通过"观察欣赏学生——选拔培养干部——强化自我管理模式——推广管理模式——培养自我管理能力"这一途径对班集体进行管理，受到了显著的效果。

一、学生自我管理的意义。

是社会上的人们对自己生命运动和实践的一种自我调节。它以每个具有自我意识和独立人格的个人为对象，以现代哲学、管理学、伦理学、生理学、心理学、社会学、教育学、成功学、人材学、行为科学、系统论、自控论和信息论等科学原理和方法为指导，使人们通过科学的有目的自我认知和自我调控，逐步走向自我完善和完美，从而达到自我实现自我成就和自我超越的一门科学与艺术，也是去充分调动人的身心灵的自动调节功能，最大限度的激发人的潜能，更有效的发掘和实现人的最大社会价值和责任的一门科学与艺术。

所谓"自我管理"是指学生自己主动采取的用来控制和协调班集体、小组、个人以及各种环境、物质因素的行为。它主要有以下三方面的重要意义。

（一）实行自我管理是班集体教育的基本要求。

自我管理是学生自我教育的一个重要因素，它弥补了集体教育模式中的不足。可以说，班集体教育的顺利进行离不开学生的自我管理。几十名学生组成的一个班集体，光班主任、科任教师几个人的力量，是无法取得较好的管理效果的。引导全班的每一个同学，发扬主人翁精神，个个都成为班集体管理工作的积极参与者，班集体方能成为健康完整的有机体。

（二）引导学生自我管理，可以提高他们的自我教育能力。

从根本上说，少年儿童是否受到良好的教育，有内外两方面因素的影响。而引导学生自我管理正是其内部因素发挥积极作用的重要途径，使学生在更好的环境中接受教育。

（三）引导自我管理，可以培养学生独立的个性。

教育的最终目的是培养社会需要的合格人才。合格人才有着无比深广的含义。怎样才算是合格人才呢？那就是具备现代化的、合理的智能结构，还应该具备独立完善的个性的人才。"独立"不仅仅指不依赖父母，有较强的生活自理能力，更重要的是指学生具有较强的辨别是非的能力，能够独自解决学习生活中遇到的各种各样的问题。培养学生的自我管理的能力，有利于学生适应各种各样的环境，最终顺利成为"社会人"。

二、学生自我管理的途径。

在日常的级务管理中，怎样帮助班主任引导学生的自我管理呢？

（一）观察、欣赏学生。

每当开学时，首先我要细心观察各个班的特点，班主任的工作方式，关注每个班是否有表现突出的学生，跟着做好记录，并详细做好分析，制定一份培养班干可行方案设想，与班主任商量一番后就选定好跟踪对象来进行观察，把他们的平时表现行为习惯、学习习惯登记好。并有意用欣赏的眼神、信任的语言、爱抚的动作去创造一个平等、宽松、和谐的环境与他们接触、交谈，尝试让他们知道学校领导注意他们关心他们。使他们快速消除紧张的师生情绪，热爱新的集体、新的老师，从而主动、活泼的参与学习、活动。也通过活动体现他们的工作能力。给培养班干提供了原材料。

（二）慎重选拔、培养班干部。

通过以上的观察，认真对他们做出分析：看他们是否要注重学习成绩，更要看思想是否积极进取；看他们是否注重个人品行修养，更要看在学生中的威信。最后选拔合适人选集中开会，要求他们找出三个为班服务的理由，看他们是否注重组织管理能力，更要看无私奉献意识。这样选出的班干部，他们都具有勤奋好学、乐于奉献、善与合作、勇于创新的精神。对整个班集体能够起到示范带头作用。接着就是一番的干部培训，重点提出自己的培养设想： 历史上那些极成功的人——拿破仑、达芬奇、莫扎特，一直都在进行自我管理，在很大和度上，也正是自我管理使他们成为伟大的成功者。但他们只是人群中极个别的例外，无论从他们的才能还是从他们所取得的成就来看，都是非同凡响而非常人所能及的。今天，我们中的大多数人，甚至包括那些资质平平的一般人，也应该学会自我管理。我们必须学会发展自我，学会把自己安排在一个最能做出贡献的地方。我们还应保持精神上的警觉，保证我们在 50 年的工作生活中每天都有所作为。这意味着，我们必须知道该在何时以何种方式改变我们的工作。 接着让他们知道自我管理模式的要求与细则，让他们先在班上做示范两周，两周后再总结与改进。

（三）强化自我管理模式

自我管理的直接动力来源与学生的自我服务，行为自律的要求。真正的自我服务、自我管理是学生发自内心的行动，具有明确的目的性和计划性，因此，引导自我管理首先要强化自我管理的意识。

配合少先队的文明班评比和结合本学校的特点，鼓励他们首先争创文明班和争当文明校星，热爱班级、为班服务，一般来说，少年儿童的心灵是纯洁无瑕的，他们乐于遵守纪律，乐于配合教师的工作，也乐于为集体服务。只要教育得法，每个孩子都会成为办集体管理的积极参与者。基本的途径是给予正面的强化。例如：我校实行了干部责任制、干部奖励制。形成了互相监督，交叉管理服务群体。订出的管理模式操作执行，通过每天的评价、一周的总结、班会课、晨会表扬，宣传栏的公布与表彰，提高他们的管理意识和服务意识，如：每天提前15分钟回校指挥同学们读书，安排同学搞清洁，整理好班容班貌，仪容仪表。甚至是桌椅的对整、窗帘炸好同一高度、清理窗台的灰尘、同学们的拉链同一高度等细小的规范都要做好，以便给其他同学一个示范作用。

（四）重视班级管理制度的完善和配套，推广管理模式

"班级管理是学生管理的最重要组成部分,有效的班级管理方式是维护学校秩序,保证教学质量,实现教书育人目标的基本保障。"现时学校学生管理中心需要下移，重点搞好班级建设，变"以老师为中心"的约束管理为"以班级成员为核心"自主管理，让学生们都来参加班级的管理，给予他们锻炼才干的机会，民主制定班级团队建设方案，内容包括班级管理方案、学风建设、文体竞赛、班风建设、班徽设计、班级简报等等，让同学积极地参与到班级管理中来，成为班级的主人，让他们学会自我约束、自我感悟、自我教育、自我管理、自我评价。班干能按自我管理模式操作好，同学们老师们看到效果后自然会产生推广的必要性，通过训练班干，基本明确了操作模式，靠班干带动与推广，引导自我管理，培养自我管理的能力。另外为更好地推广，我校选了一个好的班作为示范班，起带头模范作用。在班干积极、细致的工作下，良好的班风会自然形成。当然，要管理好一个班级，建设好一个班级，不仅要靠班干部发挥骨干的作用；而且要有完善的班级管理制度，保证班级工作有据可依，有章可循。首先一个班级必须有自己的班规。班规制定的依据是学校的规章制度，但是班规的制定是结合班级的实际和学生的实际，把学校的规章制度具体化，具有较强的可操作性。如制定《班干部管理制度》、《值日生职责》、《德育考核评分表》、《学生日常行为规范》、《家长-班长联系表》、《语文早读常规》、《英语早、午读常规》和《各学科作业统计表》。班规的制订和班级工作计划的制订，班主任除了在重要项目上应给予指点外，其余则要交给学生经过民主协商，征求广大同学意见的基础上制定出来。其次是要给学生留出管理的"空白"，让学生参与班级管理。让学生由"老师要管我"转变为"我要管我"，有利于形成一种"无管而无不管"的人人自管的佳境。例如：学生根据班规的要求规范自己的言行，根据班级工作计划的要求开展班级工作和活动。让学生自己根据班规的要求，对照自己的言行和同学的言行，自己得出正确与否的结论。对待学生违纪的现象，可以让违纪的同学自己对照班规，向全班同学说明自己的行为对在哪里，错在哪里，诚心接受同学的帮助。这样，既可以教育自己，又可以教育其他同学，共同进步

（五）培养自我管理能力。

当管理模式在各个班推行得风风火火时，我们就把重点从班干从班级转移到学生个体上，培育每一位同学的自我管理。班主任在管理中"要注意发挥学生的主动性，培养他们自我教育和自我管理的能力"（《学校德育工作全书》①）。在管理中充分调动每个学生参与管理的积极性，工作中尊重每个学生的意见，而不重优轻劣，让学生感到他们都是班级的主人。同时还可采取一些措施，如共同制定班级管理制度，实施班组长轮值制等，增强学生班级的主人翁意识。放手让学生组织自己的活动，独立开展工作。教师适时点拨，培养学生的组织能力。还有对一些自制力差的学生，也在管理中让出一片空白，让其自我管理，以培养他们的自控能力，指导学生正确的管理自己、管理他人，那么，要培养学生自我管理包括以下几个方面：1、目标管理，2、时间管理，3、情绪管理，4、行为管理，5、品性管理和生活管理等。这就要求我们一定要高度认识到我们高阶之路所要实现的目标和目的，并能坚定不移和坚持不懈的勇猛精进的走下去，走到底。

三、学生自我管理的效果。

经过一段时间的坚持取得了以下成绩：

（一）促进学生健康成长

通过自我管理，强调了学生的主体性，承认和尊重学生个人的自主性、自律性、能动性、积极性、创造性及选择自由，诚心帮助学生增强自主、自立、自强、自律的能力。

（二）形成了良好的班风、浓厚的学风。

全班学生品行端正，富有责任感，能明辨是非，和睦相处。同学们学习热情高，基本上做到了"今日事今日毕"，学习成绩大幅度提高。班的凝聚力大大争强了，班里日常工作得以正常进行，而且效率越来越高。

（三）班容班貌仪容仪表好，学生行为习惯得以落实。

学生通过自我管理，形成了良好的行为习惯，从学生外在的仪容仪表开始，到班容班貌，甚至是校园的环境都得到明显的改善。让整个校园充满了浓厚的文化氛围，学生老师之间以礼相待，和睦相处。

（四）各项活动成绩突出。

通过自我模式管理，学生的学习、生活热情高涨，连课外活动也积极参加，成绩还不错，如：校园的形象大赛、交通安全漫画比赛、班徽设计、征文比赛，英语小品比赛等都拿到可喜的成绩。

（五）涌现出大批有工作能力的学生干部。

每个班的学生在自我管理当中，得到了自我发挥得机会，真正地认识了自己，发挥了自己的潜能，树立了自信心，克服自卑心理，在困难和各种挫折面前锻炼了自己的毅力，涌现出大批能力强、服务意识高，学习品行优秀的学生干部。通过他们参与管理工作，促进了良好校风的形成，也促进了少先队工作的开展。

实际上，社会上的每个人，无时不在运用自我意识对自己进行激发和调控的（这是属于自发的自我管理），只不过是其自觉性有高有低罢了。不论是在修真或世俗方面，都应当首先对自己进行有目的的刻意的和科学的自我管理，进而转变为一种自然的自如的自由的和随机的自我管理。所以要提高级部的管理形成良好级风，我们要驾驶好自我管理模式，发挥好学生的自我教育功能，它对学生高尚品质、人格和情操的形成会产生巨大的影响，同时也会促进学校规范化管理，让每个班里同学迅速凝聚在一起，推动了良好班风和学风的形成，也使学生自我教育、自我管理、自我服务的能力得到锻炼。

注释：《学校德育工作全书》①1998人民日报出版社 高长梅 赵承志

参考文献

［1］ 陶秀蝉《自我管理——良好班风形成的关键》 西安高新国际学校

［2］ 李伟胜：《创建民主集体，提升生命质量——"新基础教育"研究中的班级建设》，《中小学管理》2004年第4期，转载于人大复印资料《中小学学校管理》2004（7期）；

［3］ 《衡量学生成长状况，提升班级生活质量——解读"新基础教育"班级评价方案 》，《中小学管理》2004（6）。（本文发表于《班主任之友》［武汉］2005年第10期）

［4］ 《自我管理》李海静

［5］ 黄绕波《谈谈学生自我管理的几点体会 》 二00年四月

［6］ 《自我管理》-李虹 http://www.bjhope.cn/product.asp

4.细胞标准化期间注意事项 篇四

1、果蔬纤维素嚼片必须一片一片的嚼碎吃，每片喝水250毫升，果蔬三颗吃完需5分钟；

2、不能吃油炸食物，含糖高的食物和辛辣等刺激性食物；

3、不能喝饮料、酒类、咖啡、茶水等；

4、每天步行10000步以上，想减体重更多则走的步数也要同时增加；

5、原则：食物可以少吃，不可多吃；营养素可以多吃，不可少吃；

6、六餐外，如果感觉到饥饿，就冲食蛋白质粉；

7、晚上八点时，如感到饥饿，就吃30克酱牛肉，不饿则不吃；

8、细嚼慢咽，每口食物要咀嚼30下，每餐吃30分钟（以后要养成慢食的习惯）；

9、每天要称体重，最好能监测血压；

10、每天必须坚持六餐，如起晚，时间后延；

11、饮水中加适量盐份，吃食物时要蘸酱油；

12、有低钾症状的要服用氯化钾缓释片（缺钾症状为酸软无力、出虚汗，如不服用氯化钾缓释片，也可生吃富含钾的西红柿或香蕉）；

13、有低血糖症状者，水中可加点冰糖；

14、每天早上要做酮检测条测试，以便监控当天脂肪是否被燃烧；

15、纤体过程每周一天蛋白日；

16、每天基本水量为4升，可根据体重增加，不能憋尿；

17、女性生理周期鱼油暂停；

18、每天称体重时请使用同一个电子称，穿同样衣服，参考数据才有准确的对比性。

备注：必须做到三多一少

三多：营养食品可多，水可多，运动量可多。

5.运维注意事项0重要 篇五

1.线上操作规范

测试使用

Enter前再三确认

忌多人同时操作

先看再备份后改 2.涉及数据

慎用rm-rf

备份大于一切

稳定大于一切

保密大于一切 3.涉及安全的 ssh

防火墙

精细权限控制粒度

入侵检测和日志监控 4.关于日常监控

系统运行状况

服务运行状况

日志监控（安全）5.性能调优

深入了解运行机制

调优框架以及先后

每次只调一个参数

基准测试 6.运维心态

控制心态

对数据负责

追根究底

测试和生产环境

一，线上操作规范

1.测试使用

当初学习linux的使用，从基础到服务到集群，都是在虚拟机做的，虽然老师告诉我们跟真机没有什么差别，可是对真实环境的渴望日渐上升，不过虚拟机的各种快照却让我们养成了各种手贱的习惯，以致于拿到服务器操作权限时候，就迫不及待的想去试试，记得上班第一天，老大把root密码交给我，由于只能使用putty，我就想使用xshell，于是悄悄登录服务器尝试改为xshell+密钥登录，因为没有测试，也没有留一个ssh连接，所有重启sshd服务器之后，自己就被挡在服务器之外了，幸好当时我备份了sshd_config文件，后来让机房人员cp过去就可以了，幸亏这是一家小公司，不然直接就被干了。。庆幸当年运气比较好。

第二个例子是关于文件同步的，大家都知道rsync同步很快，可是他删除文件的速度大大超过了rm-rf,在rsync中有一个命令是，以某目录为准同步某文件（如果第一个目录是空的，那么结果可想而知），源目录（有数据的）就会被删除，当初我就是因为误操作，以及缺乏测试，就目录写反了，关键是没有备份。生产环境数据被删了，没备份，大家自己想后果吧，我不想再回忆了。

测试的重要性我就不再多说了，大家自己体会吧。

2.Enter前再三确认

关于rm-rf / var 这种错误，我相信手快的人，或者网速比较慢的时候，出现的几率相当大，当你发现执行完之后，你的心至少是凉了半截。

大家可能会说，我按了这么多次都没出过错，不用怕，我只想说，呵呵，出现一次就够了。。你就明白了，不要以为那些运维事故都是在别人身上，如果你不注意，下一个就是你。（就是强制删除/var/spool/postfix/deferred 目录下所有文件和文件夹。）3.切忌多人操作

我在的上一家公司，运维管理相当混乱，举一个最典型的例子吧，离职好几任的运维都有服务器root密码，呵呵。

通常我们运维接到任务，都会进行简单查看如果无法解决，就请求他人帮忙，可是当问题焦头烂额的时候，客服主管（懂点linux），网管，你上司一起调试一个服务器，当你各种百度,各种对照，完了发现，你的服务器配置文件，跟上次你修改不一样了，然后再改回来，然后再谷歌，兴冲冲发现问题，解决了，别人却告诉你，他也解决了，修改的是不同的参数。。这个，我就真不知道哪个是问题真正的原因了，当然这还是好的，问题解决了，皆大欢喜，可是你遇到过你刚修改的文件，测试无效，再去修改发现文件又被修改的时候呢，多人同时修改很蛋疼哇。

4.先备份后操作

养成一个习惯，要修改数据时，先备份，比如.conf的配置文件，另外，修改配置文件时，建议注释原选项，然后再复制，修改。

再者说，如果第一个例子中，有数据库备份，那rsync的误操作不久没事了吧。所以说丢数据库非一朝一夕哇。。随便备份一个就不用那么惨哇。。

二，涉及数据

1.慎用rm-rf

网上的例子很多，各种rm-rf / 哇，各种删除主数据库哇，各种运维事故，，你这1s的疏忽，造成的损失可是相当重大的，呵呵，如果真需要删除就看看在看看再看看再说吧

2.备份大于一切

本来上面都有各种关于备份，但是我想把它划分在数据类再次强调，备份非常之重要哇，我记得我的老师说过一句话，涉及到数据何种的谨慎都不为过。我就职的公司有做第三方支付网站和网贷平台的，第三方支付是每两个小时完全备份一次，网贷平台是每20分钟备份一次。我不多说了，大家自己斟酌吧。

3.稳定大于一切

其实不止是数据，在整个服务器环境，都是稳定大于一切，不求最快，但求最稳定，求可用性，所以未经测试，不要再服务器使用新的软件，比如nginx+php-fpm，生产环境中php各种挂啊，重启下就好了，或者换apache就好了。说多了都是泪啊。

4.保密大于一切

现在各种艳照门漫天飞，各种路由器后门，所以说，涉及到数据，不保密能行么，除非你想成为下一个陈冠希，，哇咔咔。。

三，涉及安全

1，ssh

更改默认端口（当然如果专业要黑你，扫描下就出来了）

禁止root登录

使用普通用户+key认证+sudo规则+ip地址+用户限制

使用hostdeny类似的防爆里破解软件（超过几次尝试直接拉黑）

筛选/etc/passwd中login的用户，2.防火墙

防火墙生产环境一定要开，并且要遵循最小原则，drop所有，然后放行需要的服务端口。3.精细权限和控制粒度

能使用普通用户启动的服务坚决不使用root，把各种服务权限控制到最低，控制粒度要精细，4.入侵检测和日志监控

使用第三方软件，时刻检测系统关键文件以及各种服务配置文件的改动，比如,/etc/passwd,/etc/my.cnf，/etc/httpd/con/httpd.con等，使用集中化的日志监控体系，监控/var/log/secure，/etc/log/message，ftp上传下载文件等报警错误日志。

另外针对端口扫描，也可以使用一些第三方软件，发现被扫描就直接拉入host.deny

这些信息对于系统被入侵后排错很有帮助，切忌

有人说过，一个公司在安全投入的成本跟他被安全攻击损失的成本成正比，，安全是一个很大的话题，也是一个和基础的工作，把基础做好了，就能相当的提高系统安全性，其他的就是安全高手做的了。。

四，日常监控

1.系统运行监控

好多人踏入运维都是从监控做起，大的公司一般都有专业24小时监控运维，其重要性我就不多说了，系统运行监控一般包括硬件占用率，常见的有，内存，硬盘，cpu，网卡，os包括登录监控，系统关键文件监控，定期的监控可以预测出硬件损坏的概率，并且给调优带来很实用的功能

2.服务运行监控

服务监控一般就是各种应用，web，db，lvs等，这一般都是监控一些指标，在系统出现性能瓶颈的时候就能很快发现并解决

3.日志监控

这里的日志监控跟安全的日志监控类似，但这里一般都是硬件，os，应用程序的报错和警报信息，监控在系统稳定运行的时候确实没啥用，但是一旦出现问题，你又没做监控，你就只能呵呵了。。

五，性能调优

1.深入了解运行机制

其实按一年多的运维经验来说，谈调优根本就是纸上谈兵，但是我只是想简单总结下，如果有更深入的了解，我会更新，在对软件进行优化之前，比如要深入了解一个软件的运行机制，比如nginx和apache，大家都说nginx快，那就必须知道nginx为什么快，利用什么原理，处理请求比apache，并且要能跟别人用浅显易懂的话说出来，必要的时候还要能看懂源代码，否则一切以参数为调优对象的文档都是瞎谈

2.调优框架以及先后

熟悉了底层运行机制，就要有调优的框架和先后顺序，比如数据库出现瓶颈，好多人直接就去更改数据库的配置文件，我的建议是，先根据瓶颈去分析，查看日志，写出来调优方向，然后再入手，并且数据库服务器调优应该是最后一步，最先的应该是硬件和操作系统，现在的数据库服务器都是在各种测试之后才会发布的，适用于所有操作系统，不应该先从他入手。

3.每次只调一个参数

每次只调一个参数，这个相比大家都了解，调的多了，你就自己就迷糊了。

4.基准测试

判断调优是否有用，和测试一个新版本软件的稳定性和性能等方面，就必须要基准测试了，测试要涉及很多因素，测试是否接近业务真实需求这要看测试人的经验了，相关资料大家可以参考《高性能mysql》第三版，相当的好。

我记得我的老师曾说过，没有放之四海皆准的参数，任何参数更改任何调优都必须符合业务场景，所以不要再谷歌什么什么调优了，对你的提升和业务环境的改善没有长久作用。

六，运维心态

1，控制心态

很多rm-rf /data都在下班的前几分钟，都在烦躁的高峰，那么你还不打算控制下你的心态么，有人说了，烦躁也要上班，可是你可以在烦躁的时候尽量避免处理关键数据环境哇。。越是有压力，越要冷静，不然会损失更多。。

大多人都有rm-rf /data/mysql的经历，发现删除之后，那种心情你可以想象一下，可是如果没有备份，你急又有什么用，一般这种情况下，你就要冷静想下最坏打算了，对于mysql来说，删除了物理文件，一部分表还会存在内存中，所以断开业务，但是不要关闭mysql数据库，这对恢复很有帮助，并使用dd复制硬盘，然后你再进行恢复，当然了大多时候你就只能找数据恢复公司了，，试想一下，数据被删了，你各种操作，关闭数据库，然后修复，，不但有可能覆盖文件，还找不到内存中的表了，，结果，我就呵呵了。。

2，对数据负责

再次强调一边，生产环境不是儿戏，数据库也不是儿戏，随手备份一下会死啊。。不备份才会死的。。

3，追根究底

好多运维比较忙，遇到问题解决就不会再管了，记得去年一个客户的网站老是打不开，经过php代码报错，发现是session和whos_online损坏，前任运维是通过repair修复的，我就也这样修复了，但是过了几个小时，又出现了。反复三四次之后，我就去谷歌数据库表莫名损坏原因，1，是myisam的bug，2，是mysqlbug，3，mysql在写入过程中被kill。最后发现是内存不够用，导致OOM kill了mysqld进程。。并且没有swap分区，后台监控内存是够用的，最后升级物理内存解决。。

4，测试和生产环境