pcr扩增失败原因分析

pcr扩增失败原因分析（共2篇）

1.pcr扩增失败原因分析 篇一

pcr技术是聚合酶链反应，该技术可将极微量的靶dna特异的扩增上百万倍，从而大大提高对dna分子的分析和检测能力。pcr反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，操作复杂，所以在其操作过程中常有污染发生，即使极少量的污染也会造成假阳性，稍有差错就会出现假阴性。

本文讨论pcr扩增过程中污染的预防与对策。操作者必须熟练掌握技术，严格按操作规程操作，防止假阳性、假阴性结果的产生。

污染的原因调查

标本间的污染；采集标本的容器被污染；提取过程中加样枪污染；试剂的污染；提取过程中气溶胶的污染等。

防止污染的预防与对策

实验人员要熟练掌握pcr操作技术，严格规范操作程序，操作过程中加样枪的使用，手套、枪头、离心管应一次性使用。严格按试剂生产厂家提供的程序进行操作。

严把质量关，在操作当中总结，马上到期的试剂或刚过期试剂对pcr结果影响很大。

设立阴性质控和阳性质控：阴性质控以监测试剂是否污染，阳性质控以监测pcr反应是否成功，产物大小是否合本理论要求。

实验室设置及设备的规范化

实验室划分为4区：试剂准备区、，标本准备区、pcr循环扩增区、检测区。扩增仪的设置要符合要求，取样器刻度准确，减少pcr循环次数，只要pcr产物过剩检测水。

近年来pcr技术已普及到各基层医院，广泛地用于感染性病原体，如hbv hcv的临床检测，由于缺乏对核酸扩增检验技术完整的了解以及缺乏质量保证措施，导致部分实验室结果出现假阳性、假阴性的出现，所以操作者必须熟练掌握技术，严格按操作规程操作，防止假阳性，假阴性结果的产生。

2.pcr扩增失败原因分析 篇二

关键词：异尖科线虫,内转录间隔区,PCR技术,序列分析

异尖线虫科某些种的第3期幼虫可经鱼肉感染人体, 被吞食的幼虫能钻入消化道壁内, 或移行到其他脏器或组织内, 从而引起人的急腹症症状, 如剧烈腹痛、恶心、呕吐、腹泻等。异尖线虫病最早于1960年由荷兰的Van Thiel报道, 而后大量病例在日本、韩国、法国等国家被发现, 到目前为止, 全球人感染病例已达3万多例, 并且呈上升趋势, 我国已有病例报道。异尖线虫病已成为重要的食源性人兽共患寄生虫病[1]。

在所有的分类鉴定中, 形态学鉴定是对异尖线虫进行分类鉴定的传统方法, 但并不是理想的手段。由于鱼体内存在不同发育期的幼虫, 其形态、结构存在很大差异, 季节、宿主等因素对其器官和生殖腺的发育也可造成很大的影响[2]。近年来, 分子生物学技术被广泛应用于生物物种的分类和鉴定, 对寄生虫的分类发挥重要的作用。分子生物学逐渐发展为异尖线虫的种属鉴定方法, 它克服了传统形态学分类鉴定方法中遇到的困难, 并达到了形态学分类鉴定方法无法达到的准确程度, 可以用于鉴别异尖线虫, 并为其生活史、传播方式和种群结构提供有效的研究工具[3]。

笔者以进口冻鲭鱼体内分离的异尖科线虫为研究对象, 扩增其核糖体DNA (rDNA) 中的ITS序列, 并与GenBank公布的相应序列进行比较, 以确定其种类, 现报道如下。

1 材料

1.1 虫体样本

异尖科线虫幼虫虫体, 剖检从日本进口的鲭鱼内脏表面和消化道获得。线虫样品编号为AP, 放入75%乙醇中, -20 ℃保存, 备用。

1.2 主要试剂

通用基因组DNA提取试剂盒 (TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit) 、PCR反应缓冲液 (10× PCR Buffer) 、脱氧核糖核苷酸 (dNTP) 、Taq酶和限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4 DNA连接酶, 购自TaKaRa公司;DNA回收试剂, 购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.3 质粒和载体

E.coli DH5α, 由舟山出入境检验检疫局动植物检疫实验室保存;pMD18-T载体, 购自TaKaRa公司。

2 方法

2.1 线虫基因组DNA的提取

从-20 ℃的75%乙醇中取出单条虫体, 置于新鲜已灭菌的1.5 mL离心管中, 用纯化水洗净, 用研磨棒磨成糊状, 根据TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit进行DNA的提取, 于-20 ℃保存。

2.2 PCR扩增目的片段

以NC5 (5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′) 、NC2 (5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′) 为扩增异尖科线虫幼虫ITS序列引物 (由上海生工生物工程技术服务有限公司合成) , 以线虫DNA为模板扩增ITS片段。反应体系 (50 μL) :10×PCR Buffer 5 μL, dNTP (10 mmol/L) 2.5 μL, 上、下游引物各1 μL, DNA模板4 μL, 灭菌双蒸水36 μL, Taq酶0.5 μL。反应条件:94 ℃ 预变性5 min;94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸90 s, 共35个循环;最后72 ℃再延伸7 min。扩增产物经12 g/L的琼脂糖凝胶电泳, 于凝胶成像系统观察, 并拍照记录结果。

2.3 扩增片段的克隆及测序

以DNA 凝胶回收试剂盒纯化扩增片段, 将纯化产物连接到pMD18-T载体上, 转化至感受态细胞DH5α中[方法参照《分子克隆实验指南》 (第3版) ], 在含氨苄西林、IPTG和X-gal的LB平板培养基上于37 ℃恒温培养12 h, 经蓝白斑筛选, 挑取白色的单个菌落增菌提取质粒, 进行酶切鉴定, 筛选获得阳性克隆pMD18-T-ANITS。

2.4 测序与分析

挑选含有阳性质粒pMD18-T-ANITS的重组菌送上海生工生物工程技术服务有限公司测序, 然后将测序结果用DNAStar软件进行序列分析和比较。

3 结果

3.1 ITS序列的PCR扩增结果

以线虫基因组DNA为模板, NC5和NC2为引物进行PCR扩增, 结果可见900 bp的条带, 见图1, 与预期的目的片段大小一致。

M.100 bp DNA Ladder Marker;1.异尖科线虫ITS序列。

3.2 rDNA-ITS序列的克隆与鉴定结果

用凝胶纯化回收试剂盒回收PCR产物并将之克隆至pMD-18T载体, 转化至感受态细胞DH5α。挑取白色单个菌落培养后, 经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定, 结果出现2条带, 其中大约940 bp为插入的片段和部分载体序列, 大片段为质粒载体, 见图2。

M.100 bp DNA Ladder Marker ;1.异尖科线虫ITS序列。

3.3 序列测定结果

测序结果表明, 由NC5和NC2作为引物扩增的异尖科线虫rDNA ITS片段为900 bp, 包括ITS1 (373 bp) 、5.8S (159 bp) 、ITS2 (272 bp) 和部分18S、28S序列, 见图3。

注:斜体下画线部分为ITS1序列;正体下画线部分为ITS2序列。

阳性克隆pMD18-T-ANITS测序结果经Blast分析比对, ITS1和ITS2序列与GenBank中已知抹香鲸异尖线虫 (Anisakis physeteris) 相应基因序列 (GenBank登录号为AB277821) 同源性均为100%, 而与其他科的线虫同源性均较低。对该线虫的ITS1和ITS2序列分别构建系统进化树, 结果表明, 从鲭鱼中分离到的线虫ITS1和ITS2均与抹香鲸异尖线虫处于同一分支, 具有很高相似性, 见图4、图5, 与派氏异尖线虫 (Anisakis pegreffii) 、简单异尖线虫 (Anisakis simplex) 、短吻鲸异尖线虫 (Anisakis ziphidarum) 、典型异尖线虫 (Anisakis typica) 、对盲囊属线虫 (Contracaecum sp) 、针蛔线虫 (Raphidascaris trichiuri) 、内弯宫脂线虫 (Hysterothylacium aduncum) 和1种宫脂线虫属线虫 (Hysterothylacium bidentatum) 相似性不高, 不处于同一分支。

4 讨论

ITS是核糖体DNA中介于18S和28S之间的内转录间隔区。在生物进化过程中显示种的特征, 种内具有高度保守性, 在不同种间又有不同程度的变异。许多研究表明, ITS序列是研究寄生虫分类鉴定及遗传变异的理想标记[4,5]。以ITS为遗传标记, 结合PCR扩增及其他方法已成功地应用于多种寄生虫的分子鉴定和分类[6,7]。

试验对分离自进口鲭鱼的异尖科线虫ITS序列进行研究, 测序结果表明, 利用报道的寄生线虫通用引物NC5、NC2可以成功扩增出虫体的ITS片段。登录GenBank进行同源性分析, ITS1、ITS2序列与可能为同一个种的抹香鲸异尖线虫同源性较高, 而与其他相近科的线虫ITS序列同源性较低, 表明ITS序列具有较高的稳定性和种属特异性, 可以作为理想的遗传标记应用于寄生虫虫种分子鉴定。

参考文献

[1]曹湛, 刘劲松, 何芳, 等.异尖线虫病概述[J].热带医学杂志, 2004, 4 (4) :494-497.

[2]罗朝科.海鱼与异尖线虫病[J].畜牧与兽医, 2003, 35 (12) :40-43.

[3]曹庭盛, 李孝军, 蔡渭明, 等.简单异尖线虫PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报, 2009, 31 (4) :279-282.

[4]GASSER R B, MONTI J R.Identification of parasitic nematodes by PCR-SSCP of ITS-2rDNA[J].Mol Cell Probes, 1997, 11 (3) :201-209.

[5]TMELL K, MATTSSON J G, ALDERBOM A, et al.Pyrosequencing analysis identifies discrete populations of Haemonchus contortus from small ruminants[J].Int J Parasitol, 2003, 33 (7) :765-771.

[6]ZHU X Q, D’AMELIO S, PAGGI L, et al.SSCP-based identifica-tion of members within the Pseudoterranova decipiens complex (Nem-atoda:Ascardoidea:Anisakidae) using genetic makers in the internal transcribed of ribosomal DNA[J].Parasitol, 2002, 124:615-623.