研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤

研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤（共5篇）

1.研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤 篇一

光谱及电化学方法研究大黄酸与牛血清白蛋白的相互作用

摘要：采用荧光光谱、紫外光谱和圆二色光谱法并结合电化学方法,研究了大黄酸与牛血清白蛋白之间的相互作用.结果表明:大黄酸对牛血清白蛋白有较强的荧光猝灭作用且为静态猝灭,并计算得出不同温度下其结合常数(KA)与结合位点数(n)分别为:3.67×105,0.95(298 K);2.60×104,0.83(309 K).由热力学参数确定它们间的作用力主要是静电引力,并依据F(o)rster能最转移理论求得其结合距离为3.28 nm,同步荧光光谱及圆二色谱表明大黄酸对牛血清白蛋白的构象产生影响. 作者： 梁慧赵芳李炳奇 Author： LIANG HuiZHAO FangLI Bing-qi 作者单位： 石河子大学化学化工学院,新疆石河子,83 期 刊： 光谱学与光谱分析 ISTICEISCIPKU Journal： Spectroscopy and Spectral Analysis 年，卷(期)： ,31(9) 分类号： O657.3 关键词： 大黄酸 牛血清白蛋白 荧光光谱 圆二色谱 电化学 机标分类号： O64 O65 机标关键词： 同步荧光光谱电化学方法方法研究大黄酸牛血清白蛋白相互作用Bovine Serum AlbuminInteraction圆二色光谱法荧光猝灭作用紫外光谱转移理论圆二色谱静态猝灭静电引力结合位点结合常数参数确定不同温度作用力 基金项目： 国家自然科学基金

2.研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤 篇二

蛋白质组学简介

蛋白质组（Proteome）一词，源于蛋白质（protein）与 基因组（genome）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，这个概念最早是由Marc Wilkins 在1994年提出的。

蛋白质组（Proteome）的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一个基因组（genome），或一个细胞、组织表达的所有蛋白质（Protein）。蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别，它随着组织、甚至环境状态的不同而改变. 在转录时，一个基因可以多种mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以许多形式进行翻译后的修饰。故一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物，蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目。蛋白质组学（Proteomics）处于早期“发育”状态，这个领域的专家否认它是单纯的方法学，就像基因组学一样，不是一个封闭的、概念化的稳定的知识体系，而是一个领域。蛋白质组学集中于动态描述基因调节，对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定，鉴定疾病、药物对生命过程的影响，以及解释基因表达调控的机制。作为一门科学，蛋白质组研究并非从零开始，它是已有20多年历史的蛋白质（多肽）谱和基因产物图谱技术的一种延伸。多肽图谱依靠双向电泳（Two-dimensional gel electrophoresis， 2-DE）和进一步的图象分析；而基因产物图谱依靠多种分离后的分析，如质谱技术、氨基酸组分分析等。

蛋白质组学在大豆与根瘤菌相互作用中的研究进展

在植物与微生物相互作用机理方面，大多数植物在受到微生物共生、寄生和疾病侵害时，将通过改变体内蛋白质的表达来完成信号的感应、传递，从而引起植物相应的反应，研究相关蛋白质有利于更好的了解生物之间的相互作用，在此方面关于豆科植物根瘤的蛋白质组成比较研究已有相关报道。Wan等应用蛋白质组学技术检测了大豆根与根瘤菌的相互作用，萌发4d的幼苗经B.japonicum野生型菌株和Nodc突变体菌株处理后，收集根和根毛，用水处理过的幼苗来对比，根与根毛的蛋白质组图谱比较显示，有96个蛋白表达差异，其中，共有12个蛋白是根毛中特有的。经MALDI-TOF MS分析，一共鉴定出23个蛋白，其中几丁质酶I和胁迫诱导基因H4是根毛特有。另一方面，对照与B.japonicum野生型菌株处理的根毛采用NanoLC-Q-TOFMS/MS分析后差异表达的有16个蛋白点，其中，脂氧合酶、苯丙氨酸解氨酶和抗坏血酸过氧化物酶1都是已知的对处理有反应的蛋白；也有一些是新鉴定出的。例如，肽链内切酶CLP ATP-结合酶、磷脂酶D、泡状融合酶和伴侣蛋白。10个蛋白在野生型菌株与突变体菌株处理的根毛中有表达量的变化，这组蛋白中包含一些已知的蛋白，一些新蛋白的鉴定还需要Nodc-功能表达分析。

Panter等分离出大豆根瘤中环形细菌的膜蛋白，共获得17个膜蛋白的蛋白质数据，其中有6个蛋白质是已知功能的同源蛋白。Hoale等比较大豆根瘤和根线粒体的蛋白，在根线粒体中检测到特异蛋白，其中差异表达的蛋白参与根瘤的代写。Sarma等研究大豆和土壤细菌间的共生固氮过程，利用双向电泳技术分离类菌体蛋白，证明类菌体在氮、碳代谢中表达了一个主要的、精细的蛋白网络。Larrainzar等确定了377个根瘤蛋白。Nathan等分析大豆根瘤细胞液，鉴定了69個蛋白，包括28%碳代谢，12%氮代谢，12%活性氧代谢蛋白，这些蛋白都参与了共生固氮作用。

3.WB实验组织总蛋白提取方法 篇三

1，准备裂解液

(1)溶PMSF(将PMSF晶体溶到PMSF溶剂中，即配成10ml100mM的PMSF液体)

(2)裂解液的制备

组成：PIRA裂解液+PMSF溶剂+蛋白酶抑制剂

10mlPIRA=100ulPMSF=1片蛋白酶抑制剂

(3)将配好的裂解液放在4℃备用。

2，研磨组织(心尖)

(1)准备研钵，药勺(2把)，长镊子，保温箱(里面放入冰块)，汤勺，离心管，天平，手套(2幅)，液氮，冰盘，振荡器。

(2)将所有接触到组织的工具用液氮预冷。

(3)1人负责将组织组织给研磨者并随时加液氮(此人必须记住每次研磨者所研磨的组织的编号)2人研磨组织(多次快速)，同时一人将1.5ml离心管编号预冷去皮。

(4)将研磨好的`组织放在去皮处理的对应的离心管中称重。(用大白纸记录好每个样的重量，便于离心时配平用)。

(5)加裂解液(1mg组织加6ul裂解液)。

(6)震荡混匀后放入冰盘上，等所有的样加完后一齐在摇床上摇1h。

3，离心提取蛋白上清液

(1)提前30min预冷离心机(4℃)。

(2)配平。

(3)离心，按照配平时的组放样(13000r，5min)。

(4)取上清液，储存在-20℃备用。(提前将1.5ml的离心管编号)。

第二步BCA法测蛋白浓度

1，37℃预热水浴箱

2，配蛋白标准液

(1)准备9个1.5ml离心管并编号A,B,C,D,E,F,G,H,I

(2)按照说明书配制标准样。

3，将蛋白上清液稀释十倍

(1)准备0.5ml的离心管并编号。

(2)取上清液6ul，然后加入54ul蒸馏水，震荡混匀。

2，配BCA工作液

RagentA：B=50:1

工作液所需用量计算：

总体积=(n待测样+9标准样)×2×200ul

其中A液xx，B液xx。

3，向酶标板(96孔板)中加入蛋白和工作液

先加25ul蛋白，再加200ul工作液，每个样加两个孔。

1234596孔板视图6789101112

4，加完工作液后摇床摇30min，放入37℃水浴30min。(最好盖上盖)5，预热酶标仪37℃

6，酶标仪使用方法

(1)打开MPM6软件

(2)File-New

(3)文件-Intrument-Setup-Single-波长562nm-OK

(4)File-Readnewplate

(5)ExpertDate：Max

7，根据OD值的平均数用EXCEL计算浓度(记得x10)。

第三步制备上样蛋白

1，计算500ul上样蛋白组成

蛋白上清液+1x样缓(固定5x样缓100ul)+超纯水(可用蒸馏水代替)

(1)计算500ul上样量所需的蛋白体积

V蛋白=2ug/ul×500ul/实际蛋白浓度(ug/ul)(注意：2ug/ul可以根据实际情况调整的)

(2)计算所需超纯水体积

V水=500-100-V蛋白

(3)数据用excel计算并提前打印。

2，准备1.5ml的离心管编号。

3，将提前将5x样缓取出解冻。

4，按照excel表中数据在离心管中加入蛋白上清液，样缓以及超纯水。5，震荡混匀。

6,100℃水浴15min。

7，分装备用。

作者：尹懿

4.菠萝蛋白酶纯化方法总结 篇四

（1）沉淀法

沉淀法是粗提酶蛋白的方法之一，主要用于前期酶的初步分离和浓缩，常用的方法有盐析法，有机溶剂沉淀法，聚乙二醇沉淀法，等电点沉淀法等。用新型吸附洗涤沉淀法和单宁沉淀法也可以提取菠萝蛋白酶，操作简单，产率也较高，但酶的产量与单宁的用量密切相关，而且所含单宁有毒，导致这种方法逐渐被淘汰了。以酒精为沉淀剂提取菠萝蛋白酶时，酒精的加入量会对菠萝蛋白酶产生较大的影响，酒精的浓度太低时，不能使菠萝蛋白酶沉淀下来，浓度太高容易使酶变性失活。酒精的浓度为80%时，酶的收率最高。从茶叶中提取的多酚类物质茶多酚也可用于菠萝蛋白酶的分离，用0.5%的茶多酚提取物对菠萝汁中菠萝 蛋白酶进行沉淀最多可达78%，其最大沉淀率明显比单宁法高。（2）离子交换色谱法

离子交换色谱层析法是蛋白质研究领域内比较高效的纯化技术，目前国外用于分离菠萝蛋白酶常用的离子交换剂有Sephacryl S-200柱、Mono S阳离子交换剂、S-Sepharose、弱酸性阳离子交换树脂、CM-纤维素阳离子交换柱、Q阴离子交换柱。国内常用的有羧甲基纤维素（CMC）、二乙胺乙基纤维素（DEAE），酶的纯化过程通常是将若干色谱纯化技术联合使用来实现的。Ota最早用SephadexG-75结合CM-SephadexC-25柱层析分离得到5种茎酶的组分。用DEAE-52离子交换柱层析结合Sephadex G-75分子筛柱层析色谱法纯化果酶，能 获得比活力为12.5U/mg的单一电泳纯酶制剂。（3）固定化金属离子亲和色谱法

固定化金属离子亲和色谱法是以普通凝胶作为载体，连接上合适的螯合配体和足够暴露的金属离子，制成亲和吸附剂，进行分离纯化蛋白质的方法。此法介于高特异性的生物亲和分离法和低特异性的离子交换色谱法之间，对组氨酸基团有特异性。Huali Nie 等（2008）首次应用固定化金属亲和膜（IMAM）—肽-尼龙膜，这是一种将七肽共价固定到复合膜上作为配体的新型尼龙膜，用其从菠萝中分离和提纯菠萝蛋白酶，可使菠萝蛋白酶纯化 15.4 倍，回收率达 94.6%，而且不会造成任何变性。固定化金属亲和层析技术正逐渐被采用，Pawan Gupta等（2007）将菠萝蛋白酶成功固定在亚氨基二乙酸载体琼脂糖凝胶 6B 型中。Cu2+ 与亚氨基二乙酸（IDA）的络合被用来作为螯合配体将单个组氨酸结合到菠萝酶上。固定化高亲和性载体的制备是试图将可溶性交联菠萝蛋白酶制剂固定到铜-亚氨基二乙酸-琼脂糖凝胶上。（4）超滤法

超滤法是在离心力或较高的压力作用下，选择适当孔径的超滤膜，使水和其他小分子物质通过，而使所需酶蛋白截留的方法。利用超滤法提取酶蛋白，具有无相变、生物活性不易丧失、得率较高，不会改变溶液糖酸比等特点。用超滤法浓缩有机溶剂提取的菠萝蛋白酶产品质量好，对环境污染少，可以实现清洁生产，酶粉得率比高岭土工艺高出47%。超滤法分离提取的粗酶比活力较单宁沉淀法高2.7倍，也比酒精沉淀法高。用超滤法浓缩提取菠萝蛋白酶需要对操作条件进行研究，尽最大可能提高超滤效果，促进工业化生产。杨辉等研究认为压力差在300kPa，透过液通量为50L/m2·h时即能保持较大的流量，又不会对酶活造成损失。在对菠萝汁进行超滤的过程中，料液透过通量随压力差增加和循环速度的增大逐渐上升并趋于稳定。用超滤法浓缩提取生物大分子时因不同膜材料的透过通量和截留率不同，而导致不同的分离特性。用聚丙烯腈膜（PAN）膜浓缩工艺较适合对菠萝蛋白酶进行超滤浓缩，可使果菠萝酶回收率达93.3%，截留率达97.8%。用PSA膜超滤菠萝皮汁制得的菠萝蛋白酶酶活总回收率为65.7%。李兴，林哲甫用二氧化钛吸附菠萝果汁中的菠萝蛋白酶再用截留值2万和5万的超滤膜超滤浓缩，能获得较高比活的果酶。得到的果酶活力回收率为54%，比活力为911单位/mg。目前将纳米氧化锌吸附、陶瓷膜超滤浓缩和冷冻干燥法结合的综合性技术已达到国际先进水平，创新性较好。(5)双水相萃取法 利用两种多聚物，或多聚物与盐在水相中的不相容性，可以从细胞破碎后的细胞碎片中直接分离、纯化并浓缩蛋白质。该方法的优点是比较温和可在室温下进行，一般不造成酶的变性失活，还可提高其稳定性。与其它分离纯化方法相比，利用双水相萃取法有很多优点，如易于放大、成本低、可以连续操作、并且是环境友好的。这就使其成为分离纯化生物分子的诱人的替代方法，在国外进行了大量的应用。B.Ravindra Babu等（2008）首次使用该法从菠萝中分离纯化菠萝蛋白酶和多酚氧化酶的混合物，结果使菠萝蛋白酶的纯度提高4.0倍，得到约228%的活性回收率。双水相萃取法提供了一种有效的、经济上可行的分离纯化菠萝蛋白酶的方法。在双水相体系中用PEO–PPO–PEO 嵌段共聚物分离纯化菠萝蛋白酶，其活性回收范围为7.5%~79.5%，纯化倍数0.1~1.25倍。在双水相体系中，各种参数如聚合物的分子质量、聚合物和形成相的盐浓度和分离体系的pH对分离纯化的结果影响较大。(6)反胶团萃取法

生物技术的发展为重要生物分子的生产开辟了一条新的途径，在选择性提取的生物分子中，逆胶束有机相很有潜力发展为液液萃取的生物分离技术。反胶团是表面活性剂，使水滴稳定分散在有机溶剂中，这种表面活性剂是双亲性的有机复合物，既亲脂也亲水。反胶团萃取法有如下一些优点：不会造成原有功能或活性的损失、界面张力较低、易于规模化、有连续运作的潜力。H.Umesh Hebbar等（2008）用溴化十六烷基三甲铵/异辛烷/正己醇/正丁醇和磺酸钠/异辛烷的反胶束体系从菠萝废料的水提物中提取和初步纯化菠萝蛋白酶。用反向阳离子表面活性剂（CTAB）胶束体系能使菠萝蛋白酶获得一个较好的活性回收率可达106%，纯化 5.2 倍，而采用阴离子表面活性剂（AOT）则没有获得较好的产率。(7)新型纳米吸附剂法

随着一种以氧化铁纳米粒子为核心，聚丙烯酸为离子交换组的新型磁性纳米吸附剂的开发，其在生物分离和生物医学领域已经被广泛应用。它具有高的离子交换容量和快速的吸附/解吸率。这种纳米粒子用于菠萝蛋白酶的分离是很有效的。近年来，纳米纤维膜由于其非常大的表面积和体积比、优越的机械性能引起人们的广泛关注，Haitao Zhang 等（2010）通过一步静电纺丝技术以二甲基乙酰胺为溶剂制备出超细聚丙烯腈（PAN）纳米纤维膜，用化学的方法连接到壳聚糖的表面，共价连接到染料配体辛巴蓝上制成染料固定化亲和膜，而且可以重复使用，膜的再生显示出良好的机械性和化学稳定性。这种新开发的染料亲和膜首次用于菠萝蛋白酶的吸附，批次试验揭示出它具有一个很高的吸附菠萝蛋白酶的能力，可以实现高效率的大规模的吸附，这种低非特异性结合的亲和膜对于纯化高纯度的菠萝蛋白酶是很有效的。

供试酶液的制备（纳米二氧化钛吸附法分离纯化效果明显好于高岭土吸附法和超滤浓缩有机溶剂提取法，所得酶的比活力分别是后两者的1.94倍和3.81倍）清洗后菠萝茎在 4℃冷室中预冷 12h，组织捣碎机捣碎，加 1 倍 0.05mol/L，pH6.0 磷酸缓冲液（含 5 mmol/L 的 EDTA）浸提，缓慢搅拌，浸提 10min，4 层纱布过滤，离（4000rpm，15min），上清液即为供试酶液，蛋白质含量为 1.62 mg/mL。（菠萝果、皮中酶供试液制备方法同上）操作要点：选取干净的菠萝茎，除杂，清水中漂洗三次，沥干，放入 4℃冷室中 预冷备用。预冷后茎用高速组织捣碎机打浆，加 0.05 mol/L，pH6.0 磷酸缓冲液浸提 10min，4 层纱布过滤，滤液在 4000 rpm 条件下，离心 15min，取上清液，放入 4℃冷室中备用。1.纳米 TiO2吸附法

（纳米 TiO2的用量直接影响吸附效果。用量不足，对酶的吸附不完全；用量过多，增加处理和洗脱难度，浪费资源）（超滤过程中会发生浓差极化现象，导致菠萝蛋白酶的损失。在压力较低时，随压力增大，通量呈直线上升，但随压力增大，膜逐渐被压实，浓差极化（膜分离过程中的一种现象，会降低透水率，是一个可逆过程。是指在超滤过程中，浓差极化由于水透过膜而使膜表面的溶质浓度增加，在浓度梯度作用下，溶质与水以相反方向向本体溶液扩散，在达到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用。）现象增加，膜通量增幅变缓。）

供试酶液中加纳米 TiO2搅拌均匀→离心（4000 rpm，15min）→取沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱→搅拌（30min）→离心（4000 rpm，15min）→取上清液→超滤浓缩→冷冻干燥→酶制品。操作要点： ① 吸附、洗脱：供试酶液置于玻璃或不锈钢容器中，加入纳米 TiO2搅拌均匀，吸20~30min，离心弃上清，沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱，离心取上清。② 超滤：洗脱液先用截留分子量为 40KD 的超滤膜除去较大分子量的杂蛋白，再用截留分子量为 20KD 的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及其它小分子杂质，采用加去离子水多次超滤。③ 冷冻干燥：据共晶点确定干燥参数。④ 纳米 TiO2吸附能力再生：纳米二氧化钛吸附洗脱后，采用 0.1mol/LNaOH 溶液浸泡，再用去离子水洗涤至中性，干燥后进行重吸附实验，吸附效果可恢复 90%以上。通过正交试验得影响实验效果的因素主次为：纳米 TiO2用量＞吸附液 pH＞吸附时间＞吸附温度 高岭土吸附法（高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂，原材料消耗多，所需设备也多，酶活总回收率及纯化倍数都较低，投资较大。）

供试酶液→加 4%高岭土，搅 20min，10℃吸附 30~60min→静置→吸出上清→沉淀用 16%NaOH 调 pH6.5~7.0→加 7%~9%NaCl，搅 30min→压滤，滤液用 1:3（体积比）盐酸调 pH5.0→搅拌→加滤液量 25%（NH4）2SO4→溶解→4℃静置过夜→离心→沉淀→干燥（王平诸等，2002）。操作要点：

①吸附：将供试酶液加入吸附槽中搅拌，同时加入 4%的高岭土，搅拌约 20min，在 10℃吸附 30~60min，用虹吸排掉上清液，收集高岭土吸附物。

②洗脱：用 16%的 NaOH 溶液调节吸附物的 pH 至 7.0 左右，再加入吸附质量为 7%~9%的工业食盐，搅拌 30min 进行洗脱，然后迅速压滤，收集滤液。

③盐析：将压滤液收集在盐析槽中，用 1:3 的盐酸调节 pH 至 5.0 左右，搅拌加入压滤液质量 25%的硫酸铵，待完全溶解后，4℃过夜；然后离心，收集沉淀盐析物，干燥即为粗酶。

3.超滤浓缩有机溶剂沉淀提取

供试酶液→超滤浓缩→有机溶剂沉淀→干燥→酶制品。

操作要点：①超滤：供试酶液先用截留分子量为 40KD 的超滤膜除去较大分子量 的杂蛋白，再用截留分子量为 20KD 的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及 其它小分子杂质。

②有机溶剂沉淀：将浓缩液降温至 0~4℃，边搅拌边加入-20℃的 95% 乙醇，直至混合液中乙醇浓度为 50%，静置，使酶沉淀，移出上清液，即 为湿酶。

③干燥：将湿酶在 0℃下减压干燥即得菠萝蛋白酶制品。2.4.4.5 离子交换层析条件的确定（D.R.马歇克等，1999.）

pH：配制pH5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 的0.01 mol/L Tris-磷酸盐缓冲液（含0.01 mol/LNaCl及1 mmol/LEDTA）。量取离子交换树脂 1mL，用蒸馏水充分冲洗，定量到 10mL 悬浆。取 7 个 2mL 离心管，每管加入 1mL 离子树脂悬浆，分别用上述缓冲液平衡。去掉多余缓冲液。按纳米二氧化钛吸附法最佳条件制得供试酶样品，配成一定浓度酶液。取 1mL 样品与相应缓冲液等量加入离子树脂中，混匀，离心取上清液，测酶活性。离子强度：取 4 支 2mL 离心管各加入 1mL 离子树脂悬浆，分别用含0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L NaCl 的初始 pH6.0 的 0.01 mol/LTris 缓冲液充分润洗 1~4 号试管，使离子树脂与相应缓冲液平衡，去掉多余缓冲液，向各管中加入 1mL 样品及等量缓冲液。混匀，静置 10min，离心取上清，测酶活性。吸附容量：取4支2mL离心管加入同初始缓冲液平衡后的离子交换树脂0.2mL。用离心管处理样品，于1、2、3、4号管中各加入1mL、2mL、3mL、4mL的样品。混匀，离心取上清液，测酶活性。离子交换层析：（1）PH的确定pH6.0的0.01mol/LTris-磷酸盐缓冲液（2）洗脱液的浓度采用 1.5mol/L 的 NaCl 溶液作为梯度洗脱的上限浓度。（3）吸附容量的测定为保证柱层析效率和菠萝蛋白酶的回收率拟选择 1mL 为最佳吸附容量。

离子交换法的详细步骤.1 离子交换介质处理与转型

用初始缓冲液替换倾倒澄清掉 20%乙醇，并用初始缓冲液配成凝胶匀浆（凝胶占 75%，缓冲液占 25%），作真空脱气处理备用。2 装柱与平衡

将所有材料和试剂平衡至室温，配制初始缓冲液为 20mM pH4.0 的醋酸缓冲液（含 0.01%的 EDTA）和洗脱液为 1M NaCl~20mM pH4.0 醋酸缓冲液（含 0.01%EDTA）。根据试验中柱子（1.1cm×30.0cm）的类型取所需量的凝胶，打开层析柱顶部，关闭出口，用 20mM pH4.0 的醋酸缓冲液润湿层析柱柱内及柱子底端并保持一小段液位，略高出滤膜，仔细驱除底端气泡。将凝胶匀浆用玻璃棒引导边搅拌边沿着柱内壁按同一方向连续倾倒入柱内，防止空气泡的产生，同时用缓冲液填充柱子的剩余部分。打开柱下口出水口夹子，使凝胶在柱内自由沉降，装上层析柱顶端柱头，连接好洗脱液。打开蠕动泵，调节流速，让缓冲液按一定的流速 通过，稳定柱子。用 3~4 倍柱体积的缓冲液平衡柱子，直至流出的平衡液和初始平衡液 pH 相等时表示已达到平衡。同时连接紫外检测仪，等流出液在检测仪上绘出的基线稳定后平直即可。3 加样

略微增大层析柱出口的流速，排除凝胶床表面缓冲液。打开层析柱顶塞，用移液管将透析至无 SO42-的酶蛋白溶液沿管壁从凝胶床表面上数毫米处缓慢流下。加样时应先沿柱内壁转动一周，然后移至中心缓慢小心地将样品溶液加到凝胶表面，最好避免破坏凝胶，以保持凝胶表面平坦。打开层析柱出口，让蛋白质样品溶液进入凝胶柱床内，待液面重合时，可用少许起始缓冲液洗柱内壁和床表面，关上层析柱出口。.4 洗脱

加样后用足够量的起始缓冲液淋洗，使未吸附的物质被洗出，并达到充分平衡，在凝胶表面缓慢滴加洗脱液，加至洗脱液表面与柱口形成凸面，加入 1MNaCl~20mM pH4.0 醋酸缓冲液（含 0.01%EDTA）以 1mL/min 流速，开始洗脱，同时连接紫外检测仪，调整横流泵为 1mL/min，同时以自动部分收集器收集，每5min 收集一管，分别测定每管的蛋白浓度及酶活。

二．蛋白含量测定方法

采用考马斯亮兰 G-250 法（George R，1973）测定蛋白质含量：①标准蛋白溶液的配制：称取 10mg 牛血清白蛋白溶于去离子水并定容至 100mL，配成 0.1mg/mL 的标准蛋白溶液。②考马斯亮兰 G-250 染料试剂：称 100mg 考马斯亮兰 G-250，溶于50mL 95%的乙醇后，再加入 120mL 85%的磷酸，用水稀释至 1L，过滤后贮于棕色瓶中。③标准曲线的绘制：取 7 支试管，编号后如表 1，混匀，放置 2min后，在 595nm 波长下比色测定（应在 1h 内完成），以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标。根据表 1 不同蛋白质浓度样品液分别测定吸光度，以蛋白含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线：：y＝0.0028x+0.0743；R2=0.9996；式中：y 为吸光度，x 为蛋白质浓度 μg/mL。

酶的活力测定：精密移取PH7.0的干酪酸溶液5ml与15ml的具塞试管中，置于37摄氏度恒温水浴中保温十分钟，准确取一定量的的供试菠萝蛋白酶液，用酶液激活液（ph4.5L-cys胱氨酸和EDTA-2Na配置）稀释至1ml，加入上述底物溶液中，摇匀，立即置入37摄氏度的恒温水浴中，准确反应10min，加入5ml三氯乙酸溶液中，终止反应，用力混匀，在37摄氏度恒温水浴中静置保温30min，待蛋白凝聚沉淀，然后冷却至室温于3500rpm离心10min，取上清液于275nm波长下测为其吸光度A。另取等体积的供试酶液，按上述步骤操作，对换酶液和三氯乙酸的加入顺序，测得吸光度A0。

5.研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤 篇五

蛋白质组学研究中的无标记定量方法

蛋白质定量是探索疾病发生发展状况和寻找新药靶标的重要手段.该领域最常用的技术是比较染色后的二维凝胶上蛋白点的光密度值或综合同位素标记后的`质谱峰强度方法.但此二者的样品处理方法都比较麻烦,不利于进行大规模蛋白质组的定量研究.最近几年出现了利用质谱数据进行无标记定量的方法,根据数据类型这些方法可以分为2类:基于鉴定蛋白的肽段数的方法和基于质谱峰强度的方法,在高通量大规模蛋白组定量研究中有很大优势.本综述主要介绍了这2类无标记定量方法的模型及优缺点,并比较了2类方法的灵敏度和准确度.肽段计数方法在检测蛋白丰度变化时更灵敏,而峰面积强度在评估蛋白比率时更准确.

作 者：薛晓芳 吴松锋 朱云平贺福初 XUE Xiao-Fang WU Song-Feng ZHU Yun-Ping HE Fu-Chu 作者单位：军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京,100850刊 名：中国生物化学与分子生物学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY年，卷(期)：200622(6)分类号：Q5关键词：无标记蛋白定量 质谱数 峰强度