胚胎干细胞

胚胎干细胞（精选8篇）

1.胚胎干细胞 篇一

初中《胚胎干细胞》说明文阅读答案

人类基因组工作框架图宣告完成后，人们已预见到干细胞尤其是胚胎干细胞在医学乃至整个生命科学中的巨大潜势。

什么是干细胞呢?一般而言是指那些同时具有自我更新和产生分化细胞能力的细胞。尤其在早期胚胎发生过程中，存在着可以产生构成身体各种器官和组织的干细胞。这种细胞就是胚胎干细胞，也被称为全能性细胞。到了个体发育的一定阶段甚至成体，仍有一部分细胞负责组织的更新和修复，诸如血液、肠道粘膜上皮、皮肤表皮等。这些细胞便是一般所指的特定组织的干细胞，又称为多能性细胞。

随着细胞生物学的发展，人们发现，某些成体组织不但能再生，而且可以衍生成不同的细胞类型。例如肌肉细胞在一定的`环境下可以成为有增殖能力的骨髓细胞;相反地，血液前体细胞(即未完全成熟的血细胞)也可变成肌肉细胞，甚至长出肝或脑细胞来。

正是由于上述发现，科学家们已认识到干细胞可能成为未来一种拯救生命的有效疾病治疗手段。例如，临床试验表明，小剂量纯化的造血干细胞足可使患者骨髓再生，这样便可以避免肿瘤病人进行自体骨髓移植所带来的癌细胞污染，以确保肿瘤不会复发。又如，成体神经系统中依然存在干细胞，若让它们重新活化、增殖与定向分化，则将是神经退化性疾病(如帕金森病)、脊髓损伤患者的福音。

但是，有关干细胞的研究还存在着许多因难。胚胎干细胞虽好，但其来源有限。目前胚胎干细胞多取自人工流产的极早期胚胎或是培植试管婴儿时剩余的胚胎。在造血干细胞的实验中，人们已总结出一整套与细胞分化阶段相关的细胞表面标志，这样便可从众多的混杂细胞群体中将有用的干细胞分离出来。但是其他细胞的干细胞是否也有实用的细胞表面标志或是别的识别方法还有待进一步研究。干细胞尤其是胚胎干细胞的识别、分离、增殖、定向分化将成为细胞生物学以及整个生命科学的主攻热点。

世界物理学会议上，物理学会宣布发明了一种新的机械工具——光学展宽器，可以使科学家在伦理学要求的范围内提取干细胞。这种光学展宽器已经可以每分钟检测3600个细胞，尽管这仍然不足以做到工业化分离高级别的干细胞，但是它提供了一种替代胚胎提取干细胞的方法。同时，这种技术已经用于分离那些可以分化为皮肤的低级别干细胞。

15.什么是胚胎干细胞?请根据文意用自己的话给它下一个定义。(3分)

16.指出下列句子中加点的词语所指的具体内容。(4分)

①正是由于上述发现

②这种技术已经用于分离那些可以分化为皮肤的低级别干细胞。

17.文章说干细胞的研究还存在着许多因难，那么这些困难是什么?请简要回答。(4分)

18.文章开头就说人们已预见到干细胞尤其是胚胎干细胞在医学乃至整个生命科学中的巨大潜势，那么这个潜势是什么?请根据文意和你的认识简要解答。(3分)

参考答案：

15.胚胎干细胞是指存在于早期胚胎中、可以产生构成身体各种器官和组织的全能性细胞。16.(1)某些成体组织不但能再生，而且可以衍生成不同的细胞类型。(2)用光学展宽器提取干细胞。

17.(1)干细胞来源有限(2)干细胞的识别、分离、增殖、定向分化等技术还难以掌握并工业化操作。

18.(1)干细胞可能成为未来一种拯救生命的有效疾病治疗手段。(2)克隆动物。(3)进行器官移植等。

2.胚胎干细胞 篇二

研究者针对125株人胚胎干细胞的基因组完整性进行了系统的分析。结果表明, 这些具有自我更新和分化全能性的细胞在体外长期培养过程中会出现许多共有的遗传突变、缺失和扩增, 其中4个特定染色体1号、12号、17号以及20号最容易产生变异。进一步的研究还揭示了第20条染色体长臂上的一段DNA序列扩增频率最高, 并锁定了该区域内的单个候选基因BCL2L1, 突变后过度表达BCL2L1的细胞在培养中逐渐拥有生长优势。

中科院上海生命科学研究院健康所金颖课题组与瑞金医院教授冯云开展合作研究, 已建立7株人胚胎干细胞系 (其中3株在无动物源成分的条件下建立) , 并已向国内外多家研究机构和课题组提供人胚胎干细胞系。他们所建立的中国人种胚胎干细胞系SHh ES1和SHh ES2参加了该项国际百株人胚胎干细胞遗传变异研究。这些宝贵的细胞资源既丰富了研究的覆盖面, 同时研究数据本身也为进一步分析、并向国际干细胞研究组织提供培养过程中中国人种特异的遗传突变提供了可能。

人胚胎干细胞最诱人的前景和用途是为细胞移植提供无免疫原性的分化细胞。然而, 在长期的培养过程中科学家发现, 各种细胞遗传突变在体外不断被报道。这一方面提示要优化现有的培养环境, 另一方面通过针对类似BCL2L1基因的相关靶向检测, 发现更好的技术来快速鉴别培养基中恶变的细胞, 这样才能为人胚胎干细胞的临床应用提供可能。

3.胚胎干细胞能治哪些病？ 篇三

根据细胞来源，干细胞可分为胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞（IPS）。胚胎干细胞是源自囊胚内细胞团的细胞。成体干细胞是组织或器官中的特异性干细胞，它们主要用于维持细胞功能的稳定，并负责机体的更新和创伤的愈合。诱导多能干细胞是人工诱导的干细胞，方法是导入几个外源性基因，诱导已经成型的体细胞分化为多能干细胞。

今天，在治疗疾病中，胚胎干细胞有了更多的试验结果。

治疗大脑和神经疾病

大脑神经元的损伤和病变会造成多种疾病，如帕金森氏病（又称震颤麻痹），这是最常见的神经退行性疾病之一，患病率为15～328/10万。虽然帕金森氏病的病因尚未完全明了，但其大脑的病变已经比较清楚，患者中脑的黑质致密部、蓝斑神经元色素脱失，黑质色素变淡并出现路易小体。这些变化导致这些部位及其神经末梢处多巴胺（DA）减少，当多巴胺减少≥70%时，就会产生震颤麻痹。

目前帕金森氏病是一种无法治愈的运动障碍疾病，患者存在严重的运动平衡障碍。帕金森氏病也是一种缓慢进展性疾病，开始时症状不明显，以后症状逐渐加重，先表现为一侧肢体不灵活，以后再波及另一侧。患者自觉手脚发硬，并伴有肢体抖动。此外，患者面部肌肉僵硬，口水常难以下咽，以致经常流涎，说话声细，言语不清。现在的治疗一般是让病人服用左旋多巴，这种药物能代替多巴胺发挥作用，但也存在副作用。因此，干细胞治疗是一种比较理想的方法，但是，目前这种方法还处于动物试验阶段。

瑞典隆德大学的谢恩·格拉利什等人对患帕金森氏病的大鼠进行了一项移植人的胚胎干细胞（hESC）的试验性治疗。首先是让人的胚胎干细胞衍生出多巴胺神经元，再将这种神经元移植到患帕金森氏病的大鼠的控制运动的大脑区域中。结果发现，移植到大鼠脑内的神经元能够存活，而且在5个月内能让大鼠脑内的多巴胺水平恢复正常，从而使大鼠恢复了正常的运动功能。

这一结果表明，人胚胎干细胞衍生的神经元可以成为治疗帕金森氏病的一种有效疗法，但是，还需要进行人体试验。

治疗失明

黄斑变性导致的视力下降和失明也是一种难治的疾病，但是，现在可以用干细胞移植来治疗。

黄斑位于眼底视神经盘的颞侧0.35厘米处的稍下方，处于人眼的光学中心区，是视力轴线的投影点。眼睛所注视的目标投影于黄斑区的中央凹处。一般情况下，人眼的视力检查就是查黄斑区的视觉能力。当人死亡或眼球脱离人体后，黄斑区呈现为淡黄色，因此称为黄斑。

黄斑变性通常是老龄退化的自然结果，随着年龄增加，视网膜组织退化、变薄，引起黄斑功能下降。在10%的黄斑变性病人中，负责供应营养给视网膜的微血管会出现渗漏，甚至形成疤痕，新生的不正常血管也很常见，血管渗漏的液体会破坏黄斑，引起视物变形，视力下降，过密的疤痕可致中心视力显著下降，甚至使人失明。有时，黄斑变性也可由外伤、感染或炎症引起，此病还有一定的遗传因素。

在西方国家，黄斑变性是造成50岁以上人群失明的主要原因，美国黄斑变性导致的失明比青光眼、白内障和糖尿病性视网膜病变这3种常见病致盲人数的总和还要多。中国人的黄斑变性发病率也较高，60～69岁发病率为6.04%～11.19%。目前对于黄斑变性的有效治疗方法并不多，现在干细胞治疗提供了一种有希望的疗法。

美国加州大学洛杉矶分校的祖尔斯·斯坦眼科研究所的史蒂芬·斯瓦兹等研究人员对18名患了不同程度黄斑变性的患者试用移植人胚胎干细胞治疗，既有较好的效果，又有较高的安全性，这意味着胚胎干细胞比较适合治疗黄斑变性。因为，胚胎干细胞具有分化为机体任何类型细胞的能力，如果将其移植入人体中的其他部位，会引发免疫排异和肿瘤增生等问题。但是人的眼睛可能是一个免疫豁免位点，不会对移植的干细胞产生强烈免疫反应，而且也不会造成组织增生而诱发肿瘤。

对18名黄斑变性患者移植人胚胎干细胞3年后，不仅患者仍然安全存活，而且恢复了部分视力。在前半段的研究中，研究人员让人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞，再将其注射到9位患斯塔加德黄斑营养不良症患者及9位老年性黄斑变性患者的视网膜下间隙中。他们的年龄在20～88岁，患者分别被注射了3种不同剂量的视网膜色素上皮细胞，即5万、10万及15万个视网膜色素上皮细胞。

由于视网膜色素上皮细胞能够被染色，很容易被追踪。这些细胞容易在实验室里生长，也容易被操纵和控制。在注射了视网膜色素上皮细胞后，18位黄斑变性患者中有13人增加了色素沉着，这意味着移植的视网膜色素上皮细胞正在发挥功能，而且有10人称他们的视力有改善，所有人都没有产生任何副作用。如果后期的研究能进一步证明人胚胎干细胞生成的视网膜色素上皮细胞治疗黄斑变性的有效性和安全性，这种疗法有望获得批准进入临床治疗。

治疗糖尿病

糖尿病成为今天一种典型的慢性病和富贵病，影响着千千万万的人，由于一直没有有效的治疗方法，人们对干细胞治疗抱有很大的希望。迄今，美国医学索引（美国国家医学图书馆下属的国家生物技术信息中心开发的查询系统）已收录了世界各国利用干细胞治疗糖尿病的论文1413篇，其中美国、中国、日本3个国家发表的论文最多。

现在，美国哈佛大学干细胞研究所发育生物学家道格拉斯·麦尔顿领导的研究小组发表的最新研究结果更引人注目。他们的研究表明，可以将胚胎干细胞转化成β细胞，再把后者移植到患糖尿病小鼠的身体中，小鼠能迅速恢复正常的血糖水平。据此，麦尔顿称，未来“有望在10天内治疗糖尿病，这项突破对治疗慢性疾病是前所未有的”。

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1型糖尿病形成的主要原因是，自身免疫系统攻击自身的β细胞，导致其死亡。β细胞位于胰腺，作用是分泌胰岛素。糖尿病患者主要通过注射胰岛素来维持血糖水平的稳定，这一过程需要持续的监控和关注。不能有效控制血糖水平的患者最终可能会失明，也可能导致神经损伤和心脏病。

麦尔顿等人从事干细胞治疗糖尿病的研究已经有15年时间，原因在于，他的儿子和女儿也患糖尿病，儿子在还是婴儿的时候就被诊断患了糖尿病，女儿在14岁时也被诊断患了糖尿病。如今他的儿子23岁，女儿27岁。可以说，治好孩子的糖尿病是麦尔顿研究治愈糖尿病的重要原因。

经过15年的探索，麦尔顿研究小组现在掌握了把胚胎干细胞转变成β细胞并移植到小鼠体内的技术。让胚胎干细胞转变成β细胞的过程比较复杂，需要加入5种不同的培养基，这些培养基包含有11种细胞因子，包括糖类和蛋白等物质。经过35天的培养，胚胎干细胞才会转化为β细胞。现在，他们能用一个500毫升的培养瓶制造出2亿个β细胞，这一数量足够用于治疗一名患者。

在把从胚胎干细胞转换而来的β细胞移植到患糖尿病的小鼠体内两周后，小鼠的血糖水平迅速恢复稳定。现在，麦尔顿等人正在把这种转换的β细胞移植到灵长类动物身上，以观察治疗效果。如果有效，将会进行人体试验，如果进展顺利，可能在未来几年将胚胎干细胞转换的β细胞移植到人体，以治疗糖尿病。由于疗效迅速，所以麦尔顿认为，10天就可治愈糖尿病。

目前，美国已经有2910万人患糖尿病，占整个美国人口的9.3%。2013年中华医学会糖尿病学分会公布糖尿病流行病学调查结果，中国30岁以上人群糖尿病患病率达11.6%，估计全国有1.39亿糖尿病患者，是世界第一糖尿病大国。如果干细胞治疗手段有效，将是这一庞大患病群体的福音。

但是，目前无论对于糖尿病还是神经系统疾病，胚胎干细胞治疗都面临两个难题：一是免疫排异问题，二是伦理问题。

例如，1型糖尿病本身就存在患者自身免疫系统攻击自身β细胞的问题，如果不能解决这个问题，移植到患者体内的β细胞也可能受到患者免疫系统的攻击而无法长期在患者体内存活，也就起不到根治糖尿病的作用。所以，麦尔顿研究小组现在正在探索如何避免患者机体的免疫系统攻击移植的β细胞。

伦理问题是干细胞研究一直面临的难题，尤其是胚胎干细胞，因为有人反对人类胚胎干细胞的研究，更反对用人的胚胎干细胞来治疗疾病，认为这是在谋杀婴儿。但是，如果能从胚胎干细胞的来源进行区别，可能会解决这一问题，例如利用那些因为各种意外原因而流产的胚胎。这一问题的解决可能因不同的国家及不同的法律有难易之别。所以，胚胎干细胞用于临床治疗疾病可能还有较长的路要走。

【责任编辑】张田勘

4.胚胎干细胞 篇四

细胞壁在细胞极性建立和胚胎发生中的作用

植物细胞壁是一个活性的动态结构,其结构层次与组分随着发育进程而发生变化,且广泛参与细胞的各项生命活动,特别是在参与细胞命运决定、充当细胞发育信使、调控植物胚胎早期极性建立以及模式建成等方面发挥重要作用.

作 者：何玉池 汤行春 何宇清 孙蒙祥 HE Yu-Chi TANG Xing-Chun HE Yu-Qing SUN Meng-Xiang  作者单位：何玉池,HE Yu-Chi(武汉大学生命科学学院,植物发育生物学教育部重点实验室,武汉,430072;湖北大学生命科学学院,武汉,430062)

汤行春,何宇清,孙蒙祥,TANG Xing-Chun,HE Yu-Qing,SUN Meng-Xiang(武汉大学生命科学学院,植物发育生物学教育部重点实验室,武汉,430072)

刊 名：武汉植物学研究  ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF WUHAN BOTANICAL RESEARCH 年，卷(期)：2006 24(5) 分类号：Q944 关键词：细胞壁   胚胎发育   极性  

5.胚胎干细胞 篇五

目的:观察小鼠胚胎胃发育过程中上皮细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、P53的`表达.方法:E11d～E15d胎鼠连续切片,体视学法测量胃上皮凋亡小体密度(DAB);免疫组化SABC法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、P53的表达.结果:①胃DAB峰值为E14d～E15d.②Bcl-2表达峰值为E11～13d;Bax表达峰值在E14d,P53表达峰值在E11～13d.结论:Bel-2可能具有抑制胃上皮细胞凋亡的作用;Bax可能具有促进细胞凋亡的作用;P53可能与胃上皮细胞凋亡调控的关系不密切.

作 者：林雪梅 李均 汪维伟 作者单位：林雪梅,汪维伟(重庆医科大学基础医学院组织与胚胎学教研室,重庆,400016)

李均(重庆市急救中心,重庆,400014)

6.3胚胎工程教案 篇六

教材分析：

胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。研究的对象主要是雌雄配子(卵和精子)以及早期胚胎。这部分内容常与必修教材中配子的形成过程、减数分裂、受精作用、动物的个体发育及其生命活动通过激素的调节以及选修教材中动物细胞的培养、转基因动物、克隆技术等相关知识联系起来考查。

本章内容人教版与苏教版的知识编排差别较大，苏教版教材包括动物的胚胎发育和胚胎工程、胚胎干细胞的研究及其应用两节内容。第一节动物的胚胎发育和胚胎工程包括哺乳动物生殖细胞的发生和受精作用、哺乳动物胚胎发育的基本过程、胚胎工程的主要技术与应用；第二节胚胎干细胞的研究及其应用包括胚胎干细胞及其研究进展、胚胎干细胞的应用、胚胎干细胞研究面临的挑战。

人教版教材包括体内受精和早期胚胎发育、体外受精和早期胚胎培养、胚胎工程的应用及前景、生物技术的安全性与伦理问题四部分内容。

本次课件制作大致按照人教版教材的顺序，但略作调整。主要是第三节胚胎工程的应用主要讲了胚胎移植、胚胎分割移植两种技术，对于胚胎干细胞的研究与应用则与生物技术的伦理性问题放在一起在第四节一并分析。

本节内容与第一节体内受精紧密联系是第一节的延伸，学习本节内容有助于帮助学生理解现代生物科技的发展与应用，在教学过程中力求做到从理科学生升学的实际需要出发，着重选取反映现代生物科学新进展的内容，重视理论知识密切联系学生生活实际，我国生产、生物技术等实际。同时胚胎工程应用的学习又是在体外受精技术的基础上进行的，所以，无论是从其内容，还是从其所处的地位来看，本节教学内容对理解整个胚胎工程内容具有重要的作用。

3．1体内受精和早期胚胎发育

教学目标：

1、简述胚胎工程的概念。

2、简述哺乳动物的精子和卵子的发生及受精过程。

教学重点：

1、哺乳动物精子和卵子的发生。

2、哺乳动物的受精过程

教学难点：哺乳动物受精过程中精子的获能、顶体反应、透明带反应、卵黄膜封闭作用的概念和生理功能。

教学方法：由于这节课的知识点比较零散，所以重难点的教学困难较大。基于这一点，本节课主要采用问题导学的教学模式。

教学程序：

教学过程及主要内容：

一、导入

教师导入：以2010年诺贝尔奖获得的材料引入。首先我们来了解一下胚胎工程。学生活动：仔细观察P59图，思考：（1）胚胎工程的概念。（胚胎工程指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎，还需要移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。）

（2）胚胎工程的操作对象、技术手段、理论基础分别是什么？（操作对象：早期胚胎和配子；技术手段：胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等；理论基础：哺乳动物的受精卵和早期胚胎的发育规律）

二、问题串进行教学

（一）精子的发生

教师提问：“体内受精”必须要有精子和卵细胞，因此本节第一个问题讲的就是“精子和卵子的发生”。下面请大家欣赏一幅充满活力的图片（活力四射的精子），你看到了什么？

学生回答：精子

学生活动：阅读课本P61 教师提问：（1）哺乳动物的精子是在哪里发生的？（2）精子发生时间如何？

（3）这么“充满活力的精子”又是如何形成的？ 学生回答：（1）发生场所：睾丸

（2）时间：初情期——生殖机能衰退

（3）第一阶段：初级精母细胞的形成，即精原细胞→多个初级精母细胞（通过数次有丝分裂）

第二阶段：精子细胞的形成，即1个初级精母细胞→2个次级精母细胞→4个精子细胞（通过减数分裂，即MI和MII）

第三阶段：精子的形成，即精子细胞→精子（通过变形）教师提问：精子的形成经过了哪几个阶段呢？ 学生看图：P61图3-2后回答

教师提问：每个阶段的具体变化如何？ 学生完成：学案上的概念图

教师讲解：高尔基体发育为头部的顶体，尾是由中心体演变成的，精子头是细胞核变成的，细胞质浓缩成原生质滴，呈球状，最后脱落，线粒体聚集在尾的基部形成线粒体 鞘。

教师提问：（1）哺乳动物成熟的精子分为哪几部分？（2）精子的形态和大小与动物体型大小有没有关系？ 学生活动：观察P62图3－3，回答

（1）外形似蝌蚪，分头、颈、尾三大部分。

（2）不同种动物精子的形态相似，大小略有不同，与动物的体型大小无关。

（二）卵子的发生

教师过渡：受精作用必须要有精子和卵子的结合，精子的发生我们已经了解了，那么卵子是

怎么发生的呢？请思考下列问题：（1）哺乳动物卵子发生的部位。（2）哺乳动物卵子发生时间。（3）哺乳动物卵子的发生过程。学生活动：阅读P62-63 教师出示：卵子图片 学生活动：回答(1)发生部位：卵巢

(2)时间：减数第一次分裂是在雌性动物排卵前后完成；减数第二次分裂是在精子和卵子结合的过程中完成的。

（3）A、卵原细胞→初级卵母细胞（有丝分裂，发生在胎儿期）

B、1个初级卵母细胞→1个次级卵母细胞＋第一极体（MI分裂，排卵前后完成）C、1个次级卵母细胞→1个卵子＋第二极体（MII分裂，受精时）

教师拓展：卵子受精的标志是当在卵黄膜和透明带的间隙可以观察到两个极体时，说明卵子

已经完成了受精。而且哺乳动物卵泡的形成和卵巢内的储备，是在出生前（即胎 儿时期）完成的，这是精子和卵子在发生上的重要区别。那么精子和卵子到底有哪些不同呢？完成精子和卵子发生的比较表格。

三、学生小组合作探究

教师提问：1.家畜每次射精排出的精子数以亿计，但是通常只有一个精子能够与卵子结合，这能说是一种浪费吗？怎样理解这一现象？

2.精子细胞变成精子的过程中，细胞中很多结构会消失，而细胞核和线粒体都保留下来，对这一现象怎样理解？为什么精子中的线粒体集中在尾的基部？

3.一个卵泡中能形成几个成熟的卵子？

4.排卵是指卵子从卵泡中排出，还是指卵泡从卵巢中排出？

5.刚排出的卵是成熟的卵子吗？它在母体的什么部位与精子受精？ 学生活动：分五个小组讨论，以抢答的形式进行比赛。教师提示：最难的是第一、二个问题，做如下提示：

1.如果每次排出的精子只有一个，在途中死亡可怎么办？如果有10个，中途死了5个，还剩5个呢？那如果数以亿计呢？精子与卵子完成受精是一个艰难的过程，精子需要跋山涉水才能与卵子相会，（学生大笑，活跃气氛）大量的精子在途中死亡耗损，最终只有一个精子与卵子完成受精。

2.如果没有线粒体会怎样？精子都是“游”着去和卵子结合的。

学生解答：1.如果只有1个，在途中死亡会影响这个物种的繁衍。家畜每次射精排出的精子数以亿计，这是一种生理保障机制。

2.精子和卵子结合的路途很遥远，没有了线粒体就没有了动力，这样精子就到达不了目的地。

四、问题巩固、完成作业复习再巩固

精心设计课堂过关练习，及时进行巩固，以闯关的形式进行，提高学生的积极性，活跃课堂气氛。

3.2体外受精和早期胚胎发育

教学目标：1．简述哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤；2．简述哺乳动物胚胎早期培养方法；

教学重点：1.体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义；2.哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤；

教学难点： 1.卵母细胞的采集和培养；2.精子的采集和培养； 教学方法：本节课以“自主性、探究性、合作性”为课堂学生学习的三个基本维度，结合了多媒体直观教学，通过问题衔接知识点，由教师引导，学生归纳，小组合作交流探究得出结论，体现教师的引导作用和学生的学习主体地位。小组合作交流，进行探究活动，在交流中学会分析选择，培养综合能力；师生交流，学生学会在教师引导下归纳总结知识点；

教学程序：

教学过程及主要内容：（1）创设情境，设疑引入

通过资料一“我国第一例试管婴儿”的相关资料，引入试管牛、试管羊，并提问学生什么是“试管动物技术”,提出试管动物并不是整个个体发育都是在试管里进行的。通过资料二让学生了解我国牛品种的相关资料，并提出要解决这些问题需要应用哪些技术，从而引入动物的体外受精技术和早期胚胎的培养。

（2）体外受精

以“试管牛”的工厂化生产为主线，拟出关于试管牛的技术流程的研究题目：卵母细胞的采集和培养；精子的采集和获能；受精。

学习时让学生扮演胚胎工程专家，每个小组负责一个研究题目，采取小组合作探究的方式，通过阅读课文以及相关的资料，进行小组讨论，每个小组派代表进行发言，再由其他同学补充，最后在教师的引导下归纳总结（突破重难点）。

①

卵母细胞的采集和培养

【小组1发言】简述卵母细胞的采集和培养。提问：采集卵母细胞的方法主要有哪几种？

4（超数排卵、活体采卵、从屠宰的雌性动物卵巢中采集）。

提示：根据动物的不同采用的方法不一样。

分析完卵母细胞的采集过程后，进一步提问：采集的卵母细胞是否可以马上进行受精？

联系体内受精的知识，卵母细胞要培养至减数Ⅱ分裂的中期才具备受精的能力，但是利用超数排卵取得的卵子一般可以直接进行受精。

② 精子的采集和获能

【小组2发言】简述精子的采集过程和获能。

提问：精子的采集方法主要有哪些？（假阴道法、手握法、电刺激法）。

由于这部分知识比较简单，通过学生的自学就可完成。同样联系第一节内容说明精子在受精前要进行获能处理，获能的方法根据不同动物处理的方式不同，主要有化学法和培养法。

③ 受精

【小组3发言】简述受精过程，其他同学进行补充。

结合课文中哺乳动物体外受精的示意图说明成熟的卵子和获能的精子在受精液或获能液中完成受精过程。

（3）胚胎的早期培养

本部分内容比较简单，在老师的引导下，了解胚胎的早期培养需要在比较复杂的发育培养液中进行（发育培养液的成分包括氨基酸、激素、核苷酸等）。当发育到一定时间再进行移植或冷冻保存。根据不同动物移植的时间不一样。

★总结整个体外受精的过程，画出完整的“试管牛”工厂化生产的技术流程图。

（4）体外受精的意义

分析近几年来我国体外受精技术的进展，结合实例说明体外受精能充分发挥良种母畜的繁殖潜力，为实现动物胚胎的工厂化生产提供了可能，加速了畜牧业的发展。（突出重点）

（5）巩固知识，实际应用

总结本堂课教学重点以及整个知识网络，布置课外习题，给学生任务，培养收集处理信息和解决问题的能力。

五、重难点归纳

1、卵母细胞采集的方法和操作的要领是什么？

方法一：对实验动物小鼠、兔和小家畜猪、羊等卵母细胞采集时，可先用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后在适当的时间从输卵管冲取卵子，并使其直接与获能的精子在体外受精。方法二：从刚屠宰的雌性动物体内摘取卵巢，再从卵巢中采集卵母细胞。方法三：直接从活体动物的卵巢中采集卵母细胞，叫活体采卵。需借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜，直接从活的动物卵巢中吸取卵母细胞。后两种方法适用于大家畜和大动物。

注意：后两种方法采集的卵母细胞需在体外培养成熟后才能与获能的精子受精。

2、以牛为例，从屠宰场收集卵巢中的卵母细胞进行体外受精的应用效果如何？

目前，从屠宰场废弃的卵巢中，每个卵巢平均可采集10枚左右可用卵母细胞，经体外培养成熟和受精后约可获4枚可用的胚胎，经过移植给受体母牛，最终可得到1～2头犊牛。牛的体外受精胚胎的工厂化生产已在一些发达国家开展。

3、采集精子的方法有几种？各有什么具体要求？

主要分为假阴道法、手握法和电刺激法。假阴道法是用特制的假阴道，满足雄性动物交配时对压力、温度和润滑度的要求。同时要配备有与供精动物相适应的台畜，训练动物爬跨台畜，借假阴道收集精液。手握法是通过徒手或戴乳胶手套的手，直接把握雄性动物阴茎，施以适当压力和刺激即可引起射精，并可收集富含精子部分的精液。电刺激法是采用特制的电极伸入动物的直肠直接刺激位于腰荐部的射精中枢引起射精，此方法只适用于野生或某些经济动物。此外，对于啮齿类的实验动物可在处死后从附睾尾收集精液。3．3 胚胎工程的应用与前景

教学目标：简述胚胎移植和胚胎分割；尝试联系实际讨论胚胎移植的现实意义。教学重点：胚胎移植 教学难点：胚胎分割 教学方法：情景导学 教学程序：

教学过程及主要内容：

一、情景创设

插入比利时兔、安哥拉兔的图片，让学生更加直观地感受进入本堂课的教学。问：如何利用普通的比利时兔，快速地获得大量的具有性状优良的安哥拉兔呢？ 答①：利用转基因工程，先获得安哥拉兔的优良基因，然后想办法转入普通兔子的细胞内。

师：但是我们知道控制兔子毛长短、软硬、细粗的可不是一个基因，要把他们一一找出来可不是一件容易的事情，那也就很难实现在短时内获得大量的安哥拉兔的目标了。不过你的设想很好，我们期待以后你的科研成果，把现在很难实现的科学难题解决。有请第二位同学。

答②：也许我们可以利用杂交。让普通的兔子和优良的安哥拉兔子杂交，得到的杂种兔子就同时拥有了两种兔子的特征。

师：哦，这位同学又是一个很好的设想。我们也学习过，杂交育种固然有他的优点，可以把两个优良性状集中到一个个体身上，但是我们要选出纯种的时间实在是太长了。其他同学有更好的想法吗？

答③：我们可以从安哥拉母兔的体内获得卵细胞，从雄兔体内获得精子，在体外完成受精过程得到受精卵。受精卵在体外培养成为小胚胎后可以移植到普通的比利时兔子宫内生产出安哥拉兔幼崽。这样不仅节约了安哥拉母兔怀孕和妊娠的时间，而且得到的幼崽在性状上和安哥拉兔也一致。

师：非常好！这位同学的设想如果放在一百多年前，那他就是一位天才的科学家。让我们来看看当时的科学家是如何来实现这一梦想的。

英国人W·希普于1890年在剑桥大学将纯种安哥拉兔的早期胚胎移植到一只已和同种交配、毛色特征完全不同的比利时兔的输卵管内。结果生出4只比利时仔兔和 6 2只由胚胎发育而成的安哥拉仔兔。这是世界上第一例胚胎移植，胚胎移植技术由此创始。

问：什么叫胚胎移植呢？

答：从一个母体取出胚胎，移植入另一个母体子宫，并妊娠的过程。

二、互动学习1．胚胎移植

将经济价值较高、遗传性状优秀的母畜，经过激素处理，使其超数排卵后受精，然后将发育的早期胚胎分别移植到同期发情的代孕母的子宫内，通过代孕母妊娠产仔的技术。

我们可以看到书上介绍胚胎移植的概念，跟我们自己总结出来的好像有所不同。他在胚胎移植之前还进行了一步操作——超数排卵。什么叫超数排卵呢？它的目的是什么呢？在这里我们可以了解一下。正常情况下，母畜的排卵数目都是一定的，比如说牛，一次只排一个，即使受精成功也只能产生一头小牛。但我们可以用超数排卵的方法处理，使母畜在一段时间内的排卵数目增加，受精之后就可以获得更多的优良胚胎，以提高胚胎移植的效率。那么怎么来处理呢？

利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就称为超数排卵（superovulation）。

问：胚胎移植移动到任何一头动物的子宫内都能发育吗？ 答①：不能，胚胎移植要在同期发情的母畜之间进行。

师：对！我们前面学习过，动物胚胎发育所要求的条件很复杂，要使胚胎发育正常，必须要给它创造一个适宜的环境，那就是处在同期发情的母畜的子宫。

同期发情技术：主要是借助外源激素剌激卵巢，使其按照预定的要求发生变化，使处理母畜的卵巢生理机能都处于相同阶段，从而达到同期发情。

答②：异体器官移植会发生排异现象。我想，胚胎移植跟器官移植相似，同样也会有这个问题存在。所以胚胎移植最好在同种动物雌性个体之间进行。

师：能考虑到这个问题非常好。所以胚胎移植必须符合两个条件：

一、同种动物雌性个体之间进行；

二、两者的生理状况必须一致。我们把提供胚胎的个体称为供体，而接受胚胎的个体称为受体（代孕母）。

问：移植的胚胎与代孕母之间在遗传上有什么关系？

答：在遗传上无任何关系！移植的胚胎，它的遗传物质来自它的供体双亲，而与代孕母之间只有生理上和组织上的联系，或许还有感情上。

问：所以在选择供体和受体的时候，在性状上有什么要求？ 答：供体是我们所要的优良品种，而受体只要一般品种就可以了。

师：那也就是说，胚胎移植实质就是借人家一个肚子来生孩子。又由于在遗传性状上与受体没有任何关系，所以幼崽很好地保留了供体双亲的优良性状。我们给胚胎移植另外一个大家都熟悉的名称——借腹怀胎，并且是“借劣质动物之腹怀优秀个体之胎”。

既然胚胎移植这么神奇，纳闷到底是如何进行的呢？下面我们以书上波尔山羊为例，介绍一下胚胎移植的过程（插入波尔山羊的胚胎移植过程图片）：

通过超数排卵之后的母羊和供体公羊受精之后就可以形成很多个早期胚胎，我们可以通过人工的方法，采用外科手术，将这些胚胎从母羊体内取出，在显微镜下进行质量检查，确保质量之后，在体外培养一段时间进行移植。这样就可以利用同一对波尔山羊来繁殖很多的个体。这是胚胎移植最大的意义。胚胎移植还有那些意义呢？

（1）充分发挥雌性个体的繁殖潜力（2）缩短供体本身的繁殖周期（3）保持供体优良特性（4）大规模繁殖（5）节约成本与费用（6）可用于保护珍稀动物

比如说大熊猫，它的保护等级是国家一级。为什么大熊猫的数量如此少？除了我们人为的活动影响，破坏了他们生存的家园，使他们流离失所、无家可归以外，跟他们本身的繁殖能力弱也存在着很大的关系。据科学家观察，大熊猫在人工养殖中有三大难：受精难、怀孕难、育幼难。那么对于像大熊猫这样的特殊情况，我们该如何来解决胚胎的获得问题呢？体外受精。

2．胚胎分割

指借助显微操作技术（采用机械方法）将早期胚胎切割成几等份，再移植到代孕母子宫，产生同卵多仔后代的技术。

插入4细胞期、8细胞期显微照片和胚胎分割显微操作照片，让学生比较直观地去理解抽象的概念和具体的操作。根据照片具体介绍胚胎分割的含义，学生体会和理解胚胎分割的优势和特点时就比较容易。以书上的良种牛胚胎分割为例，具体讲解胚胎分割的操作，并简单介绍我国胚胎分割的成就。

胚胎的选择：发育良好的，形态正常的桑椹胚或囊胚。（注意：如果选取的是囊胚，分割的时候要保证内细胞团平均分割，以保证胚胎的恢复和进一步发育。）

胚胎分割的优势：可成倍增加胚胎数量，可以快速繁殖良种畜。胚胎分割的特点：后代具有相同的遗传物质。胚胎分割的基本过程：（1）胚胎移入培养液；

（2）分割胚胎（机械法、酶处理）；（3）移植胚胎给受体；（4）着床产仔。

总结：今天我们学习的主要内容就是胚胎工程当中的三项主要技术：胚胎移植、体外受精和胚胎体外培养、胚胎分割，不管是通过哪种技术获得胚胎，要想得到一个新的个体，必须借助于胚胎移植。所以我们说胚胎移植是胚胎工程的核心技术，也是基础技术。没有胚胎移植技术，其他技术即使再成功，也很难保证得到个体。胚胎工程是建立在胚胎移植之上的。

三、拓展学习

胚胎移植，实质就是“借腹怀胎”。所谓“借腹生子”是指利用试管婴儿和胚胎移植技术，在受体母亲子宫内使胎儿发育成熟而生出的过程。

资料：在国外，有些不育症的夫妇采用“借腹怀胎”的方法生育孩子，即由一位正常健康妇女当代替母亲，代替另一位不能生育的妇女获得一个婴儿。具体的方法是，事先采集这位不孕妇女丈夫的精液，然后于代理母亲的排卵期用此精液人工授精，而使之怀孕生育，所生小孩与不孕妇女的丈夫有其血缘关系。根据我国有关计划生育条例规定，夫妻婚后5年未育，经县以上医疗卫生单位诊断为丧失生育能力的，按有关规定经过批准，可收养一个孩子，或允许其只生一个孩子的兄弟姐妹中的一人再生一个，由其领养其中的一个孩子。从广义范围来讲，这是在我国特定条件下的“借腹怀胎”。

倘若不育夫妇要求采用代替母亲的“借腹怀胎”，则需按有关规定经过批准，并征得双方夫妇同意，立据协议签字后，由授权允许开展人工授精的医疗单位施行。

联系实际讨论：你对新科技条件下出现的“借腹生子”现象赞同吗？

代表①：我同意。因为孩子是一个家庭的希望，也是一个家庭的根本。如果因为本身生理上的原因而不能生育，对于当事人来说是一种莫大的痛苦，如果再带来家庭的不稳定的话，更加是一种灾难。所以我觉得“借腹怀胎”应用在这类人身上是一种对生命的关爱，是可以的。

代表②：我不赞同。虽然有些家庭有一些特殊的情况，就像前一位同学所说，生理有些问题。但我想那也是少数，大多数情况下是没有问题的。那么在这些大多数的情况里面，我们不能否认有些人会利用手中的钱权来威逼利诱。比如说，自己怕疼不想生、或是要保持身材自己不想生，但却要孩子，那么他们会不会想到用钱去买一个肚子来为他们服务呢？而生活在穷困中的妇女又会不会抵挡不住诱惑而去交易呢？这样不就把自己的痛苦转移到了别人头上吗？

代表③：我也不赞成。医学一旦有了交易，肚子就成了商品。但是这个商品却不一定能够保值。在怀孕的9个多月里，孩子和代孕母亲都有可能发生意外，这些责任应该由谁来负？还有，如果孩子出生之后不健康，有遗传病或是残疾，双方都不想要这个孩子。那么，这个小生命该怎么办？还有，代孕母亲要是由于这次生育而造成她以后终生不孕，这个代价有谁来偿还？这一系列的问题，可能比较复杂，而且难以处理。所以我觉得国家不能放手，让“借腹怀胎”成为家常便饭。

代表④：我不同意以上两位同学的说法。难道说我们就有权利去牺牲少数特殊人群的利益吗？虽然有生育问题的家庭是少数，但是他们还是应该享受到现代科技给人类带来的幸福。这项技术有了，给了他们有一个孩子的希望，那么为什么要为了大多数人认为有可能引起的一些未知的问题而让他们的希望破灭呢？这是不道德的！当然，我也不否认可能会引起一些比较棘手的问题，但是国家可以制定相关的法律政策来约束某些企图不轨的人的行为，不就可以了吗？

师（总结）：由于时间关系，我们的讨论到这里，但是我知道，同学们对于这个问题的看法还是没有办法统一。实际上这个问题在医学界和科学界都还是在探讨之中，同学们如果有兴趣，课下可以去查找一些资料。主要有两种意见：（1）赞同。该措施可以帮助一些家庭解决不孕不育现象，而且可以帮助一些由于自身素质不良，如果怀胎、分娩会造成生命威胁的母亲，实现得到亲生子女的愿望。（2）不赞同。给社会和人类伦理道德造成一定的冲击。

3．4胚胎干细胞的研究与应用

教学目标： 胚胎干细胞的概念和分离途径；胚胎干细胞研究的意义。教学重点：胚胎干细胞的概念和分离途径

教学难点：关注胚胎工程的研究进展和应用价值

教学方法：由于这节课的知识点比较零散，所以重难点的教学困难较大。基于这一点，本节课主要采用问题导学的教学模式。

教学程序：

教学过程及主要内容：

仔细阅读P80-81，思考讨论：

1、胚胎干细胞的来源。

2、胚胎干细胞的功能和主要特点是什么？

3、胚胎干细胞的主要用途如何？

4、查阅资料，了解胚胎干细胞的研究历史是怎样的？

学生自主学习，完成习题

1、哺乳动物的胚胎干细胞简称_____或______细胞，来源于

__________或从______________中分离出来。

2、具有_________的特性，在形态上表现为_________小，_________大，_________明显；在功能上，具有_____________，可分化为______________体内任何一种_________。另外，在体外培养的条件下，可以__________________，可进行________保存，也可进行__________________。

3、胚胎干细胞的主要用途是：①可用于研究哺乳动物

__________________；②是在体外条件下研究____________的理想材料，在培养液中加入_____________，如牛黄酸等化学物质时，就可以诱导_________向__________________，这为揭示_________和_________的机理提供了有效的手段；③可以用于治疗__________________，如_________、_________等；④利用可以被诱导分化形成________________的特性，移植

_________可使坏死或退化的部位得以__________________；⑤随着__________________的发展，通过体外诱导分化，定向培育_________________，用于器官移植，解决供体器官不足和器官移植后__________________的问题。

师讲授：

胚胎干细胞的主要用途

(1)治疗人类的某些顽症

(2)培育出人造组织器官，用于器官移植

(3)是研究体外细胞分化的理想材料 胚胎分割

1.概念:采用机械方法将早期胚胎切割成2等份,4等份或8等份等,经移植获得同卵双胎或多胎的技术.2.特点:后代具有相同的遗传物质.3.选择的胚胎:发育良好的,形态正常的桑椹胚或囊胚.4.使用的主要仪器：实体显微镜和显微操作仪

胚胎干细胞

1.概念:简称ES或EK细胞,是由早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞.2.特点:

1)形态:体积小.细胞核大,核仁明显.2)功能:具有发育的全能性.可分化为成年动物体内任何一种组织细胞.体外培养可增殖不分化.3）在体外培养的条件下，ES细胞可以增殖而不发生分化。对它可以进行冷冻保存，也可以进行遗传改造。4.干细胞

1）种类：按照分化潜能的大小，分为专能干细胞、多能干细胞和全能干细胞。专能干细胞只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞，如成肌细胞；多能干细胞具有分化成多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，如造血干细胞；全能干细胞可以分化为全身200多种细胞类型，并进一步形成机体的所有组织、器官，如胚胎干细胞。

（2）哺乳动物的胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或从原始性腺中分离出来。

特点：具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上，具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。

7.胚胎干细胞 篇七

关键词：多潜能干细胞,骨髓,分离培养

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的不成熟细胞。骨髓可能是成体干细胞的主要来源。自从FRIEDENSTEIN首次从骨髓组织中分离到成纤维细胞样、贴壁生长的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)以来[1],国内外各实验室采用贴壁黏附培养这一经典方法获得了不同物种的MSCs[2,3],并在其可塑性和再生医学应用研究方面取得了长足进展,但MSCs其实都是一群异质细胞[4]。这种经典的分离培养方法需要探索改进。

最近的研究证实:成体骨髓中存在表达胚胎干细胞抗原标志的干细胞,运用多种方法可以分离到类似的细胞,并分别被命名为多潜能成体祖细胞(multipotential adult progenitor cells)[5]、骨髓来源成体多潜能诱导细胞(marrow-isolated adult multilineage inducile cells)[6]、很小的胚胎样干细胞(very small embryonic-like stem cells,VSELs)[7]等,为探索改进骨髓干细胞的分离扩增方法进行了有益的探索。为了方便描述这些表达胚胎干细胞抗原标志的细胞,参照KUCIA的命名方法[7],在本文中这些表达胚胎干细胞抗原标志的细胞被命名为胚胎样干细胞(embryonic-like stem cells,ELSCs)。参照BATTULA报道的技术方法[8],本室开展了从骨髓中分离ELSCs的实验研究。

1 材料和方法

1.1 材料

签署知情同意书后,从事先排除患有造血系统疾病的8岁男孩髂骨后脊处抽取10 m L骨髓,用血液保鲜液抗凝用于分离干细胞。血液保鲜液购自四川南格尔医疗有限公司。细胞培养瓶购自Corning公司。2-mercaptoethanol、明胶gelatin购自Sigma公司。DMEM/F12购自Hy Clone公司。Knockout-DMEM,serum replacement(SR),glutamine,nonessential amino acids(NEAA),新生牛血清(Newborn cattle serum,NCS),FITC-goat-anti-rabbit IgG或FITC-rabbit-anti-goat IgG均购自invitrogen公司。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)购自Cell Systems公司。免疫染色用一抗(rabbit-anti-human CD34,Oct-4,Nanog-3和goatanti-human Sox-2)购自Santa Cruz公司。

1.2 E LS C s和M S C s的分离培养

为了分离ELSCs和MSCs,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,PBS漂洗两次后分为两等分,一份用于扩增MSCs,另一份用于扩增ELSCs,扩增培养方法参照BATTULA报道的方法[8]进行,简单地说,用无血清培养基重悬单个核细胞并转移到事先用明胶包被过的培养瓶中静置培养以分离扩增ELSCs。无血清培养基是添加了20%SR、2 mmol/LL-glutamine、1%NEAA、0.1 mmol/L 2-mercaptoethanol和5 ng/ml bFGF的knockout-DMEM培养液。培养瓶的包被:每个培养瓶中加入5 m L 0.1%的明胶溶液室温条件下静置30 min,然后吸弃明胶溶液于室温条件下风干即可。作为对照,按照ELSCs培养相同的细胞密度,用含血清培养基重悬单个核细胞并转移到未包被的培养瓶中静置培养以分离扩增MSCs。含血清培养基为含10%NCS的DMEM/F12培养液。两份细胞均在37℃、5%二氧化碳的培养箱中静置培养,光学显微镜下观察细胞生长情况并拍照。每4天换液,弃除不贴壁的细胞。到细胞生长至80%融合状态时,用trypsin/EDTA消化传代细胞。取第二代细胞作免疫染色和RT-PCR分析以检测Oct-4,Nanog-3,Sox-2和CD34的表达情况。

1.3 免疫染色分析

检测细胞内表达的Oct-4、Nanog-3和Sox-2,细胞用4%甲醛固定10 min,再用0.5%Triton X-100破膜10 min。检测细胞表面表达的CD34,细胞仅仅用4%甲醛固定10 min。然后用PBS漂洗三遍,加入羊-兔血清或含3%H2O2的封闭液室温条件下作用10 min,滴加一抗(rabbit-anti-human CD34,Oct-4,Nanog-3和goat-anti-human Sox-2),4℃孵育10 h,PBS漂洗一次以去除未结合的一抗,滴加二抗FITC-goat-anti-rabbit IgG或FITC-rabbit-anti-goat IgG于室温条件下孵育30 min,再滴加DAPI孵育5 min,PBS漂洗去除未结合的二抗和DAPI。PBS替代一抗染色作为阴性对照。

1.5 R T-P C R分析

使用TRIZOL提取总RNA,取5μg RNA用于反转录合成互补DNA。PCR扩增检测Oct-4、Nanog-3和Sox-2基因的表达。PCR反应的参数为94℃反应4 min,94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,反应45个循环,最后72℃延伸7 min。GAPDH用作内参控制。不加c DNA的反应设为对照。PCR产物用经1%琼脂糖凝胶电泳检测观察照相。所用引物见表1。

2 结果

2.1 E LS C s的形态特征

采用无血清培养基(含20%SR,2 mmol/L L-glutamine,1%NEAA,0.1 mmol/L 2-mercaptoethanol和5 ng/mL bFGF的knockout-DMEM培养液)在明胶包被过的培养瓶中培养骨髓单个核细胞7~10 d后,可观察到少许贴壁生长的细胞。按照相同的细胞密度,采用经典的MSCs分离方法,即有血清培养基(含10%NCS的DMEM/F12培养液)在未包被过的培养瓶中培养骨髓单个核细胞10 d左右,也可观察到贴壁生长的细胞。但这两种培养方法扩增出的细胞形态存在明显差别。采用无血清培养基分离到的细胞,即原代ELSCs,体积较小、形态纤细均一(见图1A),细胞传代后在瓶中均匀分布生长(见图1B),更容易扩增,而且传代10代后细胞变得更长,增殖活性依然较好(见图1C)。而采用经典的有血清培养基分离到的细胞,即原代MSCs,体积较ELSCs大,常包括纺锤形、多边性和圆形等多种细胞形态(见图1D),细胞传代后后两种形态细胞迅速消失,而且细胞常呈从状分布,细胞形态扁平(见图1E),传代10代后的细胞增殖活性明显降低,细胞形态非常扁平,呈现明显的老化现象(见图1F)。

A:原代ELSCs体积纤细,形态均一;B:第三代ELSCs均匀分布生长;C:第十代ELSCs形态更加细长;D:原代MSCs显示了不同的细胞形态;E:第三代MSCs呈丛状分布生长;F:第十代MSCs呈现明显的细胞老化现象。(A、B、C、D、E、F,×40)

A:Oct-4在ELSCs的微弱表达;A1是A的放大图;B:Nanog-3在ELSCs的微弱表达;B1是B的放大图;C:Sox-2在ELSCs的微弱表达;C1是C的放大图;D:检测不到Oct-4在MSCs表达;E:检测不到Nanog-3在MSCs表达;F:检测不到Sox-2在MSCs表达;(A、B、C、D、E、F,×100)

2.2 多潜能抗原标志的免疫染色分析

取生长良好的第二代细胞做细胞爬片进行免疫染色分析,结果显示:两种方法培养的细胞均不表达CD34,表明这些贴壁生长的细胞均不是造血干细胞。采用无血清培养基扩增的ELSCs能检测到Oct-4、Nanog-3和Sox-2弱阳性表达(见图2A、A1、B、B1、C、C1),而采用经典方法扩增的MSCs没有检测到这些抗原标志的表达(见图2D、E、F)。

2.3 多潜能抗原标志的R T-P C R分析

消化收集生长良好的第二代细胞提取总RNA,RT-PCR扩增检测Oct-4、Nanog-3和Sox-2基因的表达,结果显示:在ELSCs能检测到显示Oct-4、Nanog-3和Sox-2基因的微弱表达,而MSCs检测不到这些基因的表达(见图3)。

M:2000 bp DNA marker;1:Nanog-3在ELSCs的表达;2:没有检测到Nanog-3在MSCs的表达;3:Nanog-3的阴性对照;4:Sox-2在ELSCs的表达;5:没有检测到Sox-2在MSCs的表达;6:Sox-2的阴性对照;7:Oct-4在ELSCs的表达;8:没有检测到Oct-4在MSCs的表达;9:Oct-4的阴性对照;10:GAPDH在MSCs的表达。

3 讨论

众所周知:无血清培养基(含20%SR,2 mmol/LL-glutamine,1%NEAA,0.1 mmol/L 2-mercaptoethanol和5 ng/m L bFGF的knockout-DMEM培养液)一直是用来扩增胚胎干细胞的专用培养基[9],牛血清的加入将导致胚胎干细胞的分化。运用胚胎干细胞的扩增方法来扩增骨髓干细胞是个全新的思路。本研究结果显示:使用无血清培养基可从骨髓中分离到弱表达Oct-4、Nanog-3和Sox-2、贴壁生长的ELSCs,与传统方法分离到的MSCs相比,ELSCs体积更小、形态纤细均一,传代后均匀分布生长,不易老化。bFGF是影响ELSCs分离的重要因素,作为一种重要的促有丝分裂原,它是维持人胚胎干细胞自我更新而不分化的强刺激因子[10]。其它细胞的研究也证实:bFGF的存在既可长期保存造血干细胞在无血清培养体系中的增殖能力[11],也可增加MSCs在含10%胎牛血清的培养体系中的增殖能力和成骨分化能力[12]。本研究中ELSCs形态比MSCs明显细小,其原因可能就是bFGF对细胞生长调节作用的结果。表观遗传学研究还表明[12]:bFGF对干细胞的生长调节的影响是广泛的,它对干细胞的生长调节是通过一个由正向调节和负向调节共同组成的基因网络调控完成的,其确切作用机制非常复杂还有待于进一步深入研究。

8.胚胎干细胞 篇八

摘要：从基因型、外植体、培养基、碳源、外源激素、添加物、培养条件等内外因素几个方面对果树体细胞胚胎发生的影响因子研究进展进行了综述，并探讨了存在的问题和今后的研究方向，为果树体细胞胚的研究提供参考。

关键词：果树；体细胞胚胎发生；内因；外因

文章编号：1005-345X（2016）04-0019-04 中图分类号：S601 文献标识码：A

植物体细胞胚胎发生发育与合子胚相似，是离体培养形态发生的有效途径。自1958年，Steward等和Reinert报道了胡萝卜体细胞胚发生的研究后，人们在大量的植物组织培养、单细胞悬浮培养、原生质体培养和花粉培养中都观察到体细胞胚的发生。目前我国涉及该研究的树种有数10个，已有100多种植物培育出了体细胞胚，特别是在针叶树体细胞胚发生的生理代谢、形态结构特征以及基因表达研究等方面取得了较好成果。近年来，关于果树体细胞胚发生的研究也越来越多，并已在苹果、核桃、枇杷、葡萄、荔枝、蓝莓、香蕉、草莓、枣、桃、柿等树种上成功获得体细胞胚。

作为快速繁殖和制作人工种子的重要手段的植物体细胞胚发生技术，其再生植株的最初来源是单个胚性细胞，能够克服遗传嵌合及后代分离问题，对于进行基因工程或细胞工程育种有着重要意义。体细胞胚的发生有直接途径和间接途径。前者是外植体不经过愈伤组织阶段，直接诱导分化出来；后者是通过脱分化形成愈伤组织后，体细胞胚由胚性愈伤组织发育而来。体胚的发生受多种因素影响，包括基因型、外植体类型、生长调节物质、培养条件等。本文对影响果树体细胞胚胎发生过程中的内外因素进行综述，以期为果树基因工程和细胞工程育种提供参考。

1内因

1.1基因型

基因型是影响果树体细胞胚发生的主要内因。番木瓜和猕猴桃的两性体比雄性体更易产生体胚。不同荔枝品种的同类外植体诱导胚性愈伤组织的频率不同。同一外植体的不同柑桔品种诱导胚性愈伤组织的能力也存在显著差异。欧洲葡萄较沙地葡萄和圆叶葡萄更难产生胚性愈伤。王傲雪等认为，不同基因型的适宜诱导培养条件不同，从而导致体细胞胚发生频率不同。体细胞胚的发生受基因的限制，胚性细胞或细胞团形成体胚的过程是基因新一轮表达的结果。

1.2外植体

选择适宜的外植体是诱导体细胞胚发生的关键因子之一。常见的外植体有花药、子叶、胚轴、成熟胚、幼胚、子房、茎尖、叶片、花瓣等。郏艳虹等研究表明，草莓的花药、花芽、叶片、叶柄、子叶、下胚轴均可诱导出体细胞胚，但诱导率存在显著差异，以花芽诱导率最高，可达61.74%。苹果珠心的珠孔端细胞能形成体细胞胚，而合点端却不能。邓正正对胡桃楸体细胞胚诱导的研究表明，只有授粉后13周的胚轴产生了20%的体细胞胚，而不同时期的子叶、胚根和种胚均未诱导出胚状体。罗君琴等认为，柑桔的下胚轴诱导胚性愈伤组织能力强于子叶、幼根及上胚轴。Ruan JY等认为，幼胚的发育程度对胚性愈伤组织的诱导起决定性作用。张健等以授粉后50 d的柑桔幼胚为外植体，经直接发生途径诱导体细胞胚高频发生率。但也有人认为，在幼胚的发育过程中，只有一个较短的阶段具有很强的体细胞胚发生潜能。

2外因

2.1培养基

用于果树体细胞胚发生常见的培养基有MS、B5、NN69、DKW、WPM等，其中MS为最常用的培养基，因其含有NH₄NO₃较高，利于果树体细胞胚的发生。但不同的果树种类对基本培养基的选择也有物种特异性，在葡萄体细胞胚发生过程中也有使用液体培养基的报道。柑桔在MT固体培养基的愈伤组织生长速度与体细胞胚胎发生之间的比率最佳。多数学者采用MS培养基成功诱导出胚状体。而McGranahan等认为DKW是核桃体细胞胚发生的首选培养基，WPM更适用于黑核桃。

2.2碳源

糖类不仅是体细胞胚碳源的主要来源之一，而且作为渗透剂调节培养基的渗透势，影响体细胞胚发生的速度和生长量。Yancheva等研究发现葡萄糖和果糖二者结合可提高无核葡萄胚性愈伤组织的诱导率。但多数果树体细胞胚诱导中常以3%的蔗糖作为碳源。但枣的胚状体成苗培养基需将蔗糖浓度提高到5%。荔枝幼胚在胚性愈伤组织分化过程中所需适宜的蔗糖浓度为5%，其诱导率可达64.2%，若蔗糖高于8%则显著地抑制了胚性愈伤组织分化。

2.3外源激素

诱导体细胞胚的发生需要生长素和细胞分裂素配合使用，细胞分裂素与赤霉素类在体细胞胚的发生和发育过程中起协同作用。在体细胞胚发育后期，ABA作为调节胚胎晚期发育的关键因子起着重要的作用。只有通过调节外源激素与内源激素的平衡，才能成功获得体细胞胚，形成完整植株。

2.3.1胚性愈伤组织诱导阶段胚性愈伤培养作为成功获得体细胞胚的重要阶段，是体细胞胚发生间接途径必须经历的中间阶段。胚性愈伤培养过程中外源激素添加物的重要成分是2，4-D，在番瓜、葡萄、甜樱桃、桃、板栗、芒果等果树体细胞胚诱导中广泛使用。周丽侬等认为，2，4-D虽然对荔枝幼胚的胚性愈伤组织诱导起决定性作用，但阻碍体细胞胚的进一步发育。而在利用中国樱桃对樱桃的不定根诱导胚性愈伤组织中，2，4-D起促进作用。郝建平等则认为，枣胚在2，4-D中2.0 mg/L激素条件下形成愈伤组织再转入ZT 1.0mg/L+2，4-D 0.1 mg/L的培养基中，可获的淡黄色、颗粒状胚性愈伤组织。除了2，4-D及其与细胞分裂素的组合之外，TDZ也能成功获得体细胞胚。但TDZ对植物体细胞胚发生的作用因植物种类而异，有的促进，有的抑制，TDZ对体细胞胚发生的作用可能与浓度与处理时间有关。

2.3.2体细胞胚的发生阶段在胚性愈伤组织的增殖阶段，应及时去掉或降低生长素浓度，这样有利于提高增殖率，而且有利于体细胞胚的发生。谢玉明等将荔枝花药培养胚性愈伤组织置于MS培养基上获得大量的胚状体，但后期体细胞胚成熟较慢。灰枣在激素BA0.5 mg/L和NAA 0.01 mg/L的条件下获得大量的体细胞胚。六月鲜枣体胚发生的研究表明，添加2，4-D的培养基未能获得大量胚状体，而是在添加IAA的培养基中产生了大量胚状体。

2.3.3体细胞胚的成熟及萌发阶段 一般来说，体细胞胚一旦分化出来就可以在无激素的培养基上成熟并发育成植株。如，柿下胚轴诱导形成的体细胞胚在无激素的培养基中成苗。但许多果树的体细胞胚发育成熟与转化需要一些特殊条件，葡萄体细胞胚不经处理只有3%具有成熟结构。在培养基中添加ABA可促进体细胞胚的成熟和萌发。ABA是调节胚胎晚期发育的关键因素，可促进胚胎发育和种子脱水成熟，抑制体细胞胚的早熟萌发。ABA在针叶树种和龙眼、胡萝卜、玉米、枸杞等植物体细胞胚发生过程中的作用已有较多研究。关于ABA在果树体细胞胚发生的研究较少。Cochba J.等认为，低浓度的ABA可促进柑桔体细胞胚发育。用10gmg/L ABA能明显增加野生樱桃的白色体细胞胚的发生。此外，培养基中添加GA3可提高芒果珠心组织和草莓叶片体细胞胚的萌发。

2.4其他添加物

培养基中有机附加物、渗透剂的添加等因素也会影响果树体细胞胚的发生、发育。但不同物质的影响在培养不同材料时效果有较大差异。甜樱桃胚性愈伤组织增殖过程中，添加200 mg/L的水解酪蛋白（CH）可以提高增殖效果。六月鲜枣体细胞胚萌发时添加CH100 mg/L可促进萌发成苗。此外，AgNO₃水解乳蛋白（LH）、椰乳（CM）的添加也会促进体细胞胚的发育。

2.5环境条件

合子胚的发育在生理避光条件下的子房中进行，体细胞胚的发育与合子胚相似。因此，多数研究深入开展了光照条件对体胚诱导或发育的影响。暗处理对于荔枝叶片、草莓叶片、葡萄叶片等果树胚性愈伤组织有显著的影响。对苹果叶片体细胞发生的研究发现，黑暗处理有利于体细胞胚的发生，光照条件下生长缓慢且多形成畸形胚。而有些研究认为在光照条件下利于体细胞胚的发生，适宜的培养条件在很大程度上能影响胚性愈伤组织的产生。

3存在问题和今后的研究方向